不同碳氮比对棉花黄萎病菌主要生物学性状及致病力的影响

俞 燕，蔡梦杭，徐 灿，黄家风

(石河子大学农学院/新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区高校重点实验室，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意义】由大丽轮枝菌(VerticilliumdahliaeKleb.)侵染所引起的棉花黄萎病, 每年给我国农业生产带来经济损失[1]。大丽轮枝菌具有寄主广泛、变异频繁、微菌核在土壤中存活时间长的特点，常规防治方法很难对其进行有效防治，控制黄萎病的为害，已成为当前影响棉花生产可持续发展的关键问题。研究外界碳氮营养比例的变化对大丽轮枝菌主要生物学性状及致病力造成的影响，对大田生产中通过调整施肥比例，减少大丽轮枝菌对作物造成的为害有重要意义。【前人研究进展】碳(C)和氮(N)是植物必需的主要养分，碳和氮之间的相互作用调节着植物的生长发育[2]。不同C/N处理能增强烟草叶片叶绿素的合成，影响烟草的生长发育，提高光合速率，加速光合产物的积累，更好的为植株形态建成提供物质支持[3-4]。C/N对微生物生长发育也极为重要,碳氮比低时，有利于微生物在土壤中分解有机质，增加有效氮的释放；碳氮比高时，微生物分解有机质能力受限，有效氮的释放减少，导致微生物与植物争夺土壤中的无机氮，从而不利于植物的生长及 NPP(净初级生产力)的增加[5]。王瑞等[6]研究表明，不同碳氮比对少孢节丛孢菌(Arthrobotrysoligospora)菌丝的生长产生明显的影响，菌丝生长最适合的碳氮比值为5∶1，碳氮比为80∶1时，菌丝的生长率最低，随着碳氮比值的增大，菌丝生长率下降。不同C/N对球孢白僵菌(Beauveriabassiana)的产孢能力、菌丝生长量、毒力以及酶活性都有影响，在较低C/N营养条件下球孢白僵菌的产孢能力、菌丝生物量、毒力及酶活性最强[7-9]。Hoffland等[10]研究发现，番茄灰霉病(Botrytiscinerea)引起的发病率与番茄叶片碳水化合物含量及C/N比之间呈正相关关系，番茄叶片碳水化合物合成增加，叶片的C/N增加，会促进病原菌的侵染。碳氮比营养条件不仅对植物的生长有影响，对病原菌的生长繁殖及致病力也产生一定的影响。【本研究切入点】目前关于大丽轮枝菌与碳氮营养元素之间的研究，仅仅是通过观察大丽轮枝菌在不同碳源和氮源培养基上的培养性状，寻找大丽轮枝菌生长最适的碳源及氮源培养基[11-12]，并未研究碳氮营养元素含量的变化对大丽轮枝菌造成的影响。研究不同碳氮比营养条件对大丽轮枝菌生物学性状及致病力造成的影响。【拟解决的关键问题】对培养基组分进行改进，调整查氏培养基中的C/N，记录大丽轮枝菌的培养性状、生长发育及致病力，分析C/N营养条件变化对大丽轮枝菌生物学性状及致病力造成的影响，为大丽轮枝菌的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试菌株及供试植株

棉花大丽轮枝菌落叶型菌株V592和非落叶型菌株I6，分离、鉴定，经过单孢纯化，于-80℃超低温冰箱进行保存。供试植株选用对棉花黄萎病感病的品种军棉1号和对棉花黄萎病抗病的品种中植棉2号。

1.1.2 供试培养基

根据常规的查氏培养基[13]计算出培养基中30 g蔗糖的含碳量为12.62 g，2.0 g硝酸钠的含氮量为0.33 g[14]，含钠量为0.54 g，试验为减少变量因素影响，分别用含氮量为0.33 g的硝酸铵和含钠量为0.54 g的氯化钠替代硝酸钠，其余的培养基成分和含量均不变。试验中蔗糖作为唯一碳源，硝酸铵作为唯一氮源。试验所有处理均在组分改进后的培养基中进行，各处理碳氮比(C/N)是在蔗糖一定的基础上通过改变硝酸铵的含量进行调整的，处理分别为：处理1(CM1)：C/N为25∶1；处理2(CM2)：C/N为30∶1；处理3(CM3)：C/N为35∶1；处理4(CM4)：C/N为40∶1；处理5(CM5)：C/N为45∶1；处理6(CM6)：C/N为50∶1。

1.2 不同碳氮比营养条件下大丽轮枝菌生物学性状的测定

1.2.1 不同碳氮比查氏固体培养基上大丽轮枝菌培养性状的观察

将PDA平板上培养7 d的大丽轮枝菌用打孔器取直径5 mm的菌丝块，分别接种于不同C/N查氏固体培养基上，置于26℃条件下黑暗培养，每隔1 d观察菌落形态。在菌落生长的第5和第9 d，采用十字交叉法测量菌落直径，计算菌落生长速度，菌落生长速度=(第9 d平均菌落直径-第5 d平均菌落直径)/4，并在第15 d进行拍照记录。每个处理设5次重复，测定结果进行显著性分析。

1.2.2 不同碳氮比查氏液体培养基对大丽轮枝菌产孢量、萌发率及菌丝量的测定

将PDA平板上培养7 d 的菌株用10 mm 的打孔器取10块菌饼，放入查氏液体培养基中摇培3 d，用高温灭菌过的4层纱布过滤收集分生孢子，再用无菌水调整孢子浓度至1.0×106cfu/mL。吸取100 μL孢子悬浮液，分别接种至盛有100 mL不同C/N查氏液体培养基中，26℃、200 /min摇培，分别在1 、2 、3 、4 、5 、6 d取样进行孢子浓度的测定，每个处理设3次重复，测定结果进行显著性分析。吸取1 mL上述摇培至第7 d的孢子悬浮液装入2 mL的离心管中，分别在0、6、12、48、72 h观察分生孢子萌发情况，每个处理重复3次，测定结果进行显著性分析。然后将摇培到第7 d的菌液用滤纸过滤，将滤纸上的菌丝体转至称量纸上称重(湿重)，室温过夜或烘干，称其重量(干重)，每个处理重复3次,测定结果进行显著性分析。

1.3 不同碳氮比营养条件对大丽轮枝菌致病性的测定

将PDA平板上培养7 d的菌株用10 mm的打孔器取10块菌饼，放入不同C/N查氏液体培养基中26℃，200 r/min 摇培5 d，4层纱布过滤收集各处理的分生孢子，用清水调整孢子浓度至1.0×107cfu/mL，浸根接种法接种两叶一心期棉花幼苗[15]。开始发病后，采用5级分级法进行病情调查，病级分级标准：0级：健株；1级：子叶出现病状；2级：1～2片真叶严重发病；3级：3片真叶以上表现病状 ；4级 ：植株生长点死亡或全株枯死[12,16]；分别在10、15、20、25 d记录病情指数，病情指数(病指)=[(1×1级发病株数)+(2×2级发病株数)+(3×3级发病株数)+(4×4级发病株数)]/[总株数×4(即最高病级)]。每个处理重复3次，测定结果取3次的平均值。

1.3 数据分析

利用SPSS软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同碳氮比查氏培养基对大丽轮枝菌培养性状的影响

研究表明,落叶型和非落叶型2种不同致病类型的菌株形成相似的菌落形态，气生菌丝均匀分布在菌落表面，菌落中央形成黑色微菌核，菌落生长速度无明显差异；但2个菌株产生的微菌核存在明显不同，非落叶型菌株I6在各处理中微菌核产量没有差异，落叶型菌株V592形成的微菌核随着培养基中碳氮比的增加呈现逐渐下降的趋势，CM1和CM2处理中形成的微菌核明显多于CM5和CM6处理中形成的微菌核。不同碳氮比营养条件明显影响大丽轮枝菌落叶型菌株微菌核的形成，低的碳氮比(25∶1～30∶1)有利于微菌核形成，高的碳氮比(45∶1～50∶1)不利于微菌核形成。图1

注：A：落叶型菌株V592的菌落形态，B：落叶型菌株V592的菌落生长速度；C：非落叶型菌株I6的菌落形态，D：非落叶型菌株I6的菌落生长速度 同列数据后不同小写字母表示经Duncan检验差异极显著(P< 0.05)，下同

A: Colony morphology of defoliating strain V592, B: Colony growth rate of defoliating strain V592; C: Colony morphology of non-defoliating strain I6, D: Colony growth rate of non-defoliating strain I6.The different small letters after the figure in a column mean differences extremely significant by Duncan test (P<0.05), the same as below

图1 大丽轮枝菌在不同碳氮比查氏培养基上性状
Fig.1 Cultural characteristics ofVerticilliumdahliaeon Czapek’s media with different C/N ratios

2.2 不同碳氮比查氏培养基对大丽轮枝菌产孢量、菌丝量及孢子萌发率的影响

研究表明，大丽轮枝菌的产孢量随着培养时间的延长而逐渐增加，从第3 d起产孢量开始表现明显差异。第6 d时，落叶型菌株V592和非落叶型菌株I6在CM1处理中的产孢量显著高于其它各处理的产孢量，孢子浓度分别为196.67×106cfu/mL，150.00×106cfu/mL，其次在CM2处理中的产孢量较高，孢子浓度分别为166.67×106cfu/mL ，129.56×106cfu/mL，2个菌株在CM3-CM6处理中的产孢量明显减少。低碳氮比(25∶ 1)更有利于大丽轮枝菌产孢，当碳氮比高于35∶ 1不利于大丽轮枝菌产孢。图2

2个菌株的菌丝湿重和菌丝干重均随培养基中碳氮比的升高呈明显下降趋势，在CM1处理中的菌丝量明显高于其它各处理中的菌丝量。碳氮比越低越有利于大丽轮枝菌菌丝生长。图3

2个菌株都是在CM4处理中孢子萌发率最高，显著高于其它各处理中的孢子萌发率。由此说明，不同碳氮比营养条件明显影响大丽轮枝菌的孢子萌发，40∶ 1的碳氮比更有利于大丽轮枝菌的孢子萌发。图4

注：A：落叶型菌株V592的产孢量；B：非落叶型菌株I6的产孢量

A: Conidial production ofdefoliating strain V592; B: Conidial production of non-defoliating strain I6

图2 大丽轮枝菌在不同碳氮比查氏培养基上产孢量
Fig.2 Conidial productionofV.dahliaeonCzapek’smediawithdifferentC/Nratios

注：A, B：落叶型菌株V592的菌丝量；C, D：非落叶型菌株I6的菌丝量

A, B: Mycelial yield of defoliating strain V592; C, D: Mycelial yield of non-defoliating strain I6

图3 大丽轮枝菌在不同碳氮比查氏培养基上菌丝量
Fig.3 Mycelial yield ofV.dahliaeon Czapek’s media with different C/N ratios

注：A, B：落叶型菌株V592的菌丝量；C, D：非落叶型菌株I6的菌丝量

A, B: Mycelial yield of defoliating strain V592; C, D: Mycelial yield of non-defoliating strain I6

注：A：落叶型菌株V592的分生孢子萌发率；B：非落叶型菌株I6的分生孢子萌发率

A: Conidial germination rate of defoliating strain V592; B: Conidial germination rate of non-defoliating strain I6

图4 大丽轮枝菌在不同碳氮比查氏培养基上分生孢子萌发率
Fig.4 Conidial germination rate ofV.dahliaeon Czapek’s media with different C/N ratios

注：A：落叶型菌株V592导致发病的病情指数；B：非落叶型菌株I6导致发病的病情指数；C：接种落叶型菌株V592后第20 d 的发病症状；D：接种非落叶型菌株I6后第20 d 的发病症状

A: Disease index of cotton plants inoculated with defoliating strain V592; B: Disease index of cotton plants inoculated with non-defoliatingstrain I6; C: Disease symptoms of cotton plants infected with defoliating strain V592 at 20 dpi; Disease symptoms of cotton plants infected with non-defoliating strain I6 at 20 dpi

图5 不同碳氮比查氏培养基培养的大丽轮枝菌在感病品种上的致病力
Fig.5 Disease severity and symptoms in susceptible cotton variety infected withV.dahliaecultured in Czapek’s media with different C/N ratios

2.3 不同碳氮比查氏培养基培养对大丽轮枝菌致病力的影响

用不同碳氮比营养条件培养大丽轮枝菌，分别接种不同抗性的棉花品种。在感病品种军棉1号上，不同碳氮比处理的落叶型和非落叶型菌株均在接种10 d时表现发病症状，接种15 d后，不同处理的病情指数开始表现明显差异，CM1和CM2处理的病情指数显著高于其它处理的病情指数。接种25 d时，CM1和CM2处理的病株叶片萎蔫、脱落、甚至整株枯死，V592的病情指数分别高达98.05和90.37，I6的病情指数分别为93.03和84.00，而其它处理的病情指数都显著低于CM1和CM2处理的病情指数。在感病品种上，不同碳氮比营养条件对大丽轮枝菌落叶型菌株和非落叶型菌株的致病力影响一致，低碳氮比(25:1)有利于大丽轮枝菌致病，当碳氮比高于35:1大丽轮枝菌致病力明显减弱。图5

在抗性品种中植棉2号上，不同碳氮比处理的2个菌株也是在接种10 d时表现发病症状，但是病情指数明显低于在军棉1号上的病情指数。从不同时段调查的病情指数来看，落叶型菌株V592和非落叶型菌株I6均在CM3处理中的病情指数最高，并且明显高于其它处理的病情指数。在抗病品种上，只有合适的碳氮比(35∶1)才有利于大丽轮枝菌致病，碳氮比过高或过低都不利于大丽轮枝菌致病。图6

注：A：落叶型菌株V592导致发病的病情指数；B：非落叶型菌株I6导致发病的病情指数；C：接种落叶型菌株V592后第20 d 的发病症状；D：接种非落叶型菌株I6后第20 d 的发病症状

A: Disease index of cotton plants inoculated with defoliating strain V592; B: Disease index of cotton plants inoculated with non-defoliatingstrain I6; C: Disease symptoms of cotton plants infected with defoliating strain V592 at 20 dpi; Disease symptoms of cotton plants infected with non-defoliating strain I6 at 20 dpi

图6 不同碳氮比查氏培养基培养的大丽轮枝菌在抗病品种上的致病力
Fig.6 Disease severity and symptoms in resistant cotton variety infected withV.dahliaecultured in Czapek’s media with different C/N ratios

3 讨 论

已有研究表明，大丽轮枝菌在不同氮含量培养基上形成的菌落颜色、质地无明显区别，但对大丽轮枝菌微菌核的产生量有影响，氮元素的缺乏会使大丽轮枝菌微菌核的产生量减少[17]。研究发现，不同碳氮比营养条件对大丽轮枝菌落叶型菌株的微菌核形成有影响，低碳氮比有利于微菌核的形成，高碳氮比不利于微菌核的形成。

在少孢节丛孢菌(Arthrobotrysoligospora)的研究中发现，菌丝在不同碳氮比培养基中的生长速度有明显的变化，随着碳氮比值的增大，菌丝生长率下降[6]。对球孢白僵菌(Beauveriabassiana)的研究发现，低碳氮比的营养条件有利于菌丝的生长和孢子的形成[7]。研究结果与上述研究结果一致，不同碳氮比营养条件对大丽轮枝菌的产孢能力和菌丝生长有影响，低碳氮比有利于大丽轮枝菌的产孢和菌丝生长。

不同碳氮比营养条件对大丽轮枝菌的致病力有影响，在感病品种中，低碳氮比有利于大丽轮枝菌致病，这可能与大丽轮枝菌在低碳氮比中菌核形成，分生孢子产生，菌丝生长等繁殖能力强有关。Safavi等[8]对球孢白僵菌(Beauveriabassiana)的研究发现，低C/N营养条件培养的球孢白僵菌，其毒力最强，与研究结果一致。Hoffland等[10]研究番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)发现，灰霉菌在番茄上的发病率与番茄叶片中的C/N呈正相关关系，随着番茄叶片C/N比的增加，越有利于病原菌的侵染。上述研究结果说明，外界碳氮比的变化与寄主自身碳氮比的变化都会影响真菌的致病力。研究发现，在抗病品种中，大丽轮枝菌只有在碳氮比合适的情况下才最有利于致病，这一结果与大丽轮枝菌在感病品种中的致病力结果存在差异，造成这种差异的原因可能与抗病品种中存在一些抗性基因有关，也可能是寄主品种之间的碳氮比不同所导致的，但这种差异究竟是如何造成的，还需要进一步研究。

4 结 论

不同碳氮比营养条件对大丽轮枝菌落叶型菌株和非落叶型菌株的生长、繁殖及致病力都有影响，低碳氮比(25∶1)有利于大丽轮枝菌的菌核形成、分生孢子产生和菌丝生长，在感病品种上表现出较强致病性；高碳氮比(高于40∶1)不利于大丽轮枝菌生长、繁殖和致病。