1,25(OH)2D3对肾小球系膜细胞凋亡相关因子表达的影响

唐小铁，徐洁，王丽媛，于洋，崔学彬，孙维言

原发性肾小球疾病作为临床常见疾病，是引起终末期肾脏疾病的重要原因。系膜增生性肾小球肾炎(MsPGN)属于原发性肾小球疾病的一种类型，主要由弥漫性系膜细胞异常增生导致，加之患者肾脏细胞外基质病理性聚集共同作用导致发病[1-2]。研究发现，肾小球系膜细胞(HMC)凋亡与MsPGN的发病密切相关，这是因为在HMC细胞凋亡的过程中会大量消耗增殖细胞，加速致病进程[3]。因此在MsPGN治疗过程中，对系膜细胞的增殖进行抑制、加快细胞凋亡，能对过度增殖性系膜细胞进行消除，获得治疗效果。相关研究显示，1，25(OH)2D3能抑制HMC增殖速度，加速凋亡，但其具体机制仍未阐明[4]。Caspase蛋白因子在细胞凋亡过程中发挥关键作用，其中Caspase-3活性能反映细胞凋亡程度。而表皮生长因子(EGF)对细胞体外增殖存在促进作用[5]。基于此，本研究对1，25(OH)2D3对肾小球系膜细胞凋亡相关因子表达的影响进行分析，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)HMC细胞株：由武汉科技大学附属普仁医院实验中心提供，并经免疫荧光实验、形态学观察鉴定；(2)试药与试剂：1，25(OH)2D3；Caspase-3活性检测试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒(美国Sigma公司)；兔抗人Caspase-3单克隆抗体、p-Akt(磷酸化Akt)单克隆抗体、Caspase-8单克隆抗体、Caspase-9单克隆抗体(深圳华大基因研究院)；(3)仪器设备：T100型PCR 仪(美国Bio-Rad公司)、MCO-18AIC型CO2培养箱(日本SANYO)、Falcon 96孔悬浮细胞培养板(美国BD公司，货号 CM001923);低温冰箱(日本 SANYO公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及分组： 2017年10月—2018年9月在武汉科技大学附属普仁医院肾内科实验室进行实验。选择由链霉素100 mg/L、10% 胎牛血清(FBS)及青霉素100 U/ml组成的L-DMEM完全培养基实施HMC细胞株复苏，在37℃饱和湿度的CO2(浓度为5%)培养箱内进行培养。根据2×105/ml密度将对数期HMC接种在6孔板内，待细胞彻底贴壁后，再于饥饿条件下持续培养24 h，分成A组(空白对照组)、B组(EGF组)、C组[1，25(OH)2D3组]、D组[EGF、1，25(OH)2D3联合组]。其中A组于5%胎牛血清DMEM培养基内进行培养，B组于培养基内加入EGF(10 ng/ml)培养液，C组加入1，25(OH)2D3(10-8mol/L)培养液，D组加入EGF(10 ng/ml)培养液和1，25(OH)2D3(10-8mol/L)培养液。

1.2.2 Caspase-3蛋白活性检测：4组经48 h干预培养后，开展细胞裂解实验[6]，并经BCA蛋白定量试剂盒对提取蛋白表达进行测定，在96孔板底酶标板内准确配置等量的反应体系，其中包括缓冲液80 μl、Ac-DEVD-pNA 10 μl、待测样品10 μl，混匀后孵育4 h。待颜色变化，测定吸光度值。

1.2.3 细胞凋亡相关因子测定[7]：采用Western blot法对4组的Akt、p-Akt及Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白进行测定。细胞裂解后，经高速离心25 min，分离上清液；置入Loading Buffer煮沸10 min，促使蛋白变性。再分别开展上样电泳及PVDF转膜，用TBST溶液洗涤6次(每次5 min)，滴入ECL发光试剂，经X线片曝光；Akt、p-Akt及Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表达量以其与GAPDH的灰度比值表示。

1.2.4 Caspase mRNA水平测定[8]： 选择荧光实时定量PCR法对Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的mRNA表达进行测定，选取4组细胞，应用TRIzol法对RNA进行提取，并经反转录试剂盒使总RNA反转录为cDNA，所有操作全部参照说明书执行，参照说明书设计Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9引物的上游、下游、引物长度。将PCR反应体系设置为25 μl，在42℃环境下开展反转录30 min，99℃ 5 min，促使反转录酶的活性丧失。记录基因扩增Ct阈值，选择2-△△ct计算各个mRNA基因表达量。

2 结 果

2.1 Caspase-3蛋白活性比较 A组、B组、C组及D组Caspase-3蛋白活性分别为(0.890±0.004)、(0.362±0.005)、(1.376±0.010)、(1.001±0.002)； B组

2.2 p-Akt/Akt值比较 A组、B组、C组、D组的p-Akt/Akt比值分别为(0.240±0.005)、(0.599±0.026)、(0.047±0.004)、(0.439±0.060)；C组

图1 4组HMC内p-Akt、Akt蛋白的表达

2.3 Caspase蛋白表达 Caspase-3及Caspase-9蛋白表达C组>D组>A组>B组(q=5.156、5.436、7.326；5.074、5.982、6.513,P均<0.01)； Caspase-8蛋白的表达4组比较，差异无统计学意义(q=0.165、0.178、0.204,P均>0.05)，见表1。

表1 4组Caspase蛋白表达情况

2.4 Caspase mRNA基因表达 Caspase-3 mRNA、 Caspase-8 mRNA及Caspase-9 mRNA基因表达C组>A组>D组>B组(q=15.672、17.526、19.421，5.168、5.689、6.024，6.425、6.974、7.654，P均<0.01)，见表2。

表2 4组Caspase mRNA基因表达情况

3 讨 论

原发性肾小球肾炎作为肾小球疾病常见类型，为引起晚期肾病的首要病因，多见于MsPGN。研究发现，MsPGN是一种呈弥漫性肾小球系膜细胞增生的系膜基质增生性疾病，早期主要表现为系膜细胞数量异常增多[9-10]。因此，临床认为对系膜细胞增生进行抑制，加快系膜细胞凋亡为控制MsPGN靶点，故探究HMC增生抑制原理，寻找诱导HMC凋亡药物对于治疗肾小球肾炎就显得尤为重要[11]。研究显示，B组细胞的凋亡机制复杂多变，实验中可以从细胞表面死亡受体内质网以及线粒体等信号途径通路进行探究[12]。Akt属于蛋白激酶B，是人体细胞因子与其他下游蛋白刺激的重要组成部分，共同参与调节信号通路，于线粒体介导性内源性凋亡通路内起到主要作用[13]。本研究显示，B组Caspase-3的活性低于A组，并且p-Akt/Akt比值高于A组，说明B组HMC相关凋亡活性显著减弱，这可能与p-Akt/Akt比值升高存在相关性，而Akt磷酸化在加快HMC增殖及阻断其凋亡过程中可能起到参与作用。结果显示，于线粒体凋亡通路初期阶段，热休克蛋白(HSP)家族内HSP27和Akt互相作用，能对凋亡发生进行介导。Akt磷酸化能减弱凋亡信号的调节激酶1相关活性，通过抑制原癌基因蛋白质与Akt磷酸化底物的结合，阻断Caspase-9蛋白的活化，从而阻止细胞凋亡[14]。活化Caspase-3仅能于凋亡细胞内检出，故对Caspase-3活性改变进行检测可观察到细胞早期凋亡，进而反映细胞凋亡活性改变[15]。

Caspase起始蛋白可被活化成活性蛋白水解酶，对下游相关效应凋亡蛋白酶进行切割，而活化性效应凋亡蛋白酶能对保持细胞结构、活动的相关蛋白实施裂解，从而促进细胞凋亡，多由Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9诱导凋亡[16]。研究数据显示，Caspase-3蛋白因子为细胞凋亡期间关键性终末剪切酶，于细胞程序性死亡过程中发挥关键作用[17]。本研究结果表明，A组Caspase-3及Caspase-9 mRNA的表达均高于B组，说明加快HMC增殖后，和凋亡有关的Caspase-3蛋白及Caspase-9蛋白的表达均减少，加之分析A组p-Akt/Akt比值低于B组，认为HMC增殖后，能经Akt磷酸化减少Caspase-3蛋白、Caspase-9蛋白表达，进而对细胞凋亡过程进行抑制。细胞因子于凋亡的3条途径内，Akt为线粒体介导性凋亡通路的主要交汇点，能经磷酸化或与凋亡相关因子互相作用对细胞凋亡进行调节[18]。Caspase-8是死亡受体途径的主要启动因子，在对其活化诱导后，能对其下游相关同源酶进行进一步链式水解，后将其效应物Caspase-3的生物效应激活，相关研究发现Caspase对细胞分化存在促进作用，可对细胞自噬进行调节，加速细胞迁移。

1，25(OH)2D3是维生素D3主要生物活性形式，作为类固醇激素能调节钙磷、肾素血管紧张素释放、免疫系统、胰岛素分泌、神经系统功能。相关研究显示，1，25(OH)2D3能阻断细胞增生、加快细胞凋亡，降低系统性硬化症及糖尿病等相关慢性疾病出现风险[19]。本研究结果表明，A组Caspase-3蛋白活性低于C组、D组，且B组Caspase-3蛋白活性低于D组；说明1，25(OH)2D3干预治疗后能增强正常的HMC凋亡活性，且能增强增殖后HMC相关凋亡活性，提示1，25(OH)2D3能加快HMC凋亡。同时，本结果显示，A组p-Akt/Akt比值高于C组，Caspase-3、Caspase-9 mRNA的表达均低于C组；说明1，25(OH)2D3能经阻断Akt磷酸化，使Caspase-3、Caspase-9 mRNA表达上调，增加HMC凋亡活性，加快HMC凋亡。而B组p-Akt/Akt比值高于D组；说明1，25(OH)2D3能增强增殖后HMC的凋亡活性，分析原因可能与阻断Akt磷酸化，使Caspase-3、Caspase-9 mRNA表达上调存在相关性[20]。

综上所述，1，25(OH)2D3可使增殖后HMC相关凋亡活性增强，通过抑制Akt磷酸化，上调Caspase-3蛋白及Caspase-9蛋白表达，从而增强HMC凋亡活性，加速凋亡进程。

利益冲突：无

作者贡献声明

唐小铁:研究方案设计，整理资料、分析资料、撰写论文；徐洁：收集整理资料，参考书籍查找；王丽媛：收集整理资料，分析数据，图表设计；于洋：修改论文；崔学彬、孙维言：收集资料