HIV/AIDS患者外周血程序性死亡受体-1的表达及临床意义

陈 琛，赵长城2，王 勇，徐前明，刘 亚

艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)侵犯并破坏机体免疫系统引起的疾病，对人类健康造成极大威胁。最近，以调控协同刺激分子信号通路为代表的治疗策略，为改善HIV/AIDS患者的免疫功能提供了新的手段和理念。

程序性死亡受体-1(programmed death-1，PD-1)是与T淋巴细胞功能耗竭和凋亡有关的协同刺激分子，可以细胞膜型和可溶性两种形式存在。既往对该分子的研究大多采用流式细胞术对膜型蛋白进行测定，但对其可溶性形式(soluble PD-1，sPD-1)的表达水平及临床意义则鲜有报道。因此，本文拟通过半定量RT-PCR法测定PD-1 mRNA的表达，并使用ELISA方法测定血清中sPD-1蛋白的表达水平，以分析其在HIV 致病过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1研究对象 收集安徽省立医院感染病院2017年6月-2017年12月HIV/AIDS病例共61例，包括31例依从性良好的接受抗病毒治疗及30例未接受抗病毒治疗的患者，均为男性，平均年龄40.81±14.11岁。所有病例确认均符合中华人民共和国HIV/AIDS国家诊断标准，排除梅毒、乙肝、丙肝、结核等系统性感染性疾病。另选健康者35例，均为男性，平均年龄42±6.38岁。本研究经安徽省立医院传染病院医学伦理学委员会批准(No. 20161124002)，并经患者知情同意。

1.1.2主要试剂 淋巴细胞分离液(天津灏洋，LTS1077)；核酸提取试剂盒(厦门泰普，RNA-blood-M)；反转录试剂盒(TaKaRa，RR036A)；内参GAPDH引物(上海生工，B661104)；BD MultitestTMCD3/CD8/CD45/CD4(美国BD Pharmingen，340499)；人类免疫缺陷病毒I型核酸定量检测试剂盒(厦门安普利，R2222)；Human PD-1 ELISA Kit(上海LanpaiBio公司，013655)。

表1 调查对象基本情况

Tab.1 Characteristics of the study population

项目例数(百分比%)年龄治疗组(n=31)未治疗组(n=30) <20岁4(12.90)2(6.67) 20-55岁20(64.52)20(66.67) >55岁7(22.58)8(26.6)CD4+ (个/mm3) >35010(32.26)8(26.67) <35021(67.74)22(73.33)CD4/CD8 >1.55(16.13)2(6.67) 0.5-1.517(54.84)16(53.33) <0.59(29.03)12(40.00)HIV viral loads(IU/mL) <1.00×103 18(56.07)13(43.33) 1.00×103 -1.00×1059(29.03)11(36.67) >105 4(12.90)6(20.00)

1.2.3主要仪器 TaqMan实时荧光定量RT- PCR 扩增仪(厦门安普利9800型)；全自动核酸提取工作站(厦门安普利Anas 1000)；FACS Calibur流式细胞仪(BD公司，美国)；凝胶成像系统(上海勤翔，CLINX GenoSens1860)。

1.2 实验方法

1.2.1标本的采集及处理 所有研究对象均为清晨空腹采血，用普通促凝真空采血管和EDTA-K2抗凝真空采血管采静脉血各2 mL。促凝血室温静置30 min，2 000× g离心10 min后取血清，-80 ℃冻存备用；抗凝血标本置4 ℃保存，6 h内送检。

1.2.2CD4+T淋巴细胞数量的测定 在流式细胞分析管中加入EDTA-K2抗凝血50 μL，按照BD MultitestTM CD3/CD8/CD45/CD4抗体试剂盒说明书，用FACSCalibur流式细胞仪检测CD4+T淋巴细胞数。

1.2.3PD-1 mRNA水平的测定

1.2.3.1引物设计及合成 针对PD-1 基因序列设计特异性引物，引物序列为：上游: 5-CGGCCAGTTCCAAACCCT-3′，下游: 5′-CCATTCCGCTAGGAAAGACA-3′。交由南京擎科生物科技有限公司进行引物合成。

1.2.3.2人外周血单个核淋巴细胞(PBMCs)的分离 按照人外周血淋巴细胞分离液说明书进行操作。将EDTA-K2抗凝血350 × g离心10 min。将血浆弃去，保留血细胞，稀释。加入Ficoll淋巴细胞分层液。向分层液上面的淋巴细胞层中加入清洗液10 mL，颠倒混匀。离心，倒掉上清，弹散细胞团后，将PBMC浓度调至2.0×106·mL-1，备用。

1.2.3.3cDNA的合成 按照说明书操作，采用RNA提取试剂盒提取PBMCs中的总RNA。利用反转录试剂盒，将获得的总RNA逆转录合成cDNA第一链。反转录体系为：5× PrimeScript RT Master Mix 2 μL，Total RNA4 μL，Rnase Free ddH2O 4 μL。反应条件为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。

1.2.3.4半定量PCR 以反转录合成的cDNA为模板，同时对目的基因PD-1 和内参基因GAPDH 进行半定量PCR扩增。PCR反应体系为：ddH2O 7 μL，Premix Taq 10 μL，上下游引物各1 μL(10 μmol·L-1)，DNA模板1 μL。扩增条件为95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸12 s，30个循环，72 ℃终延伸10 min。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。在凝胶成像分析仪中使用Image-Pro Plus观察扩增得目的片段，并得出其灰度值(IOD)。

1.2.4血清sPD-1蛋白水平的测定 采用双抗体夹心ELISA法检测血清sPD-1的浓度，操作步骤分别参照检测试剂盒说明书进行。简要操作步骤如下：将sPD-1标准品依次稀释，在96孔板中分别加入50 μL血清样品或标准品，室温孵育1 h，洗涤5次，然后加入50 μL酶标二抗室温孵育1 h，洗涤5次，加入50 μL显色剂避光孵育15 min，反应结束后加入50 μL终止液，酶标仪读取450 nm吸光度值，根据标准品吸光度绘制标准曲线，然后计算血清sPD-1的浓度。sPD-1检测试剂盒的检测下限分别是1.2 pg/mL。

2 结 果

2.1应用半定量RT-PCR检测临床标本的结果 选择GAPDH作为内参基因，半定量检测HIV/AIDS患者与健康人群PBMCs中PD-1 mRNA表达水平。结果显示，未治疗组、治疗组、健康组相对表达量均数分别为0.337 8±0.064、0.578 2±0.073和0.771 5±0.124，健康组与未治疗组差异有统计学意义(P<0.001)，健康组与治疗组、治疗组与未治疗组差异有统计学意义(P=0.031、P=0.043)(图1)。

*，P<0.05； **，P<0.01； ***，P<0.001。图1 PD-1 mRNA在健康人群及HIV/AIDS患者的相对表达量Fig.1 Relative expression of PD-1 mRNA in healthy and HIV / AIDS groups

2.2HIV/AIDS患者血清sPD-1表达水平 未治疗组、治疗组、健康组血清sPD-1浓度分别为42.22±2.21 ng/mL、38.24±2.79 ng/mL和29.88±1.41 ng/mL(图2)。健康组与未治疗组、治疗组，治疗组与未治疗组分别具有统计学差异(P=0.008、P=0.040和P=0.020)。

图2 HIV/AIDS患者与健康人群sPD-1含量Fig.2 Concentrations of sPD-1 in serum from HIV-infected individuals and healthy controls

2.3不同CD4+T淋巴细胞数的HIV/AIDS患者血清sPD-1的差异 国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册[1]建议成人/青少年HIV/AIDS患者CD4+T淋巴细胞数低于350 个/mm3时要给予抗病毒治疗。根据CD4+T淋巴细胞数高低，将HIV/AIDS患者治疗组及未治疗组分别再细分为<350 个/mm3和>350个/mm3亚组进行差异性分析。结果表明，未治疗组、治疗组CD4+T淋巴细胞数<350 个/mm3患者血清sPD-1水平均显著高于CD4+T淋巴细胞数>350 个/mm3患者(P=0.035、P=0.047)。

图3 不同CD4+T淋巴细胞数量水平的HIV/AIDS患者血清sPD-1Fig.3 Serum sPD-1 in HIV / AIDS patients with different CD4+T lymphocyte levels

3 讨 论

近年来随着对机体免疫调节机制认识的逐步深入，协同刺激分子在机体免疫中发挥的作用受到了越来越广泛的重视。作为介导负性协同刺激信号的重要途径，PD-1/PD-L1 通路在机体免疫应答过程中扮演着重要的角色，在免疫耐受、移植排斥、自身免疫性疾病以及肿瘤和慢性病毒感染等方面发挥了极为重要的生物学作用[2]。

PD-1与HIV-1感染具有紧密的联系。谢荣华[3]等人的研究证实了PD-1是HIV 感染疾病进展的标志之一。另据报道，PD-1在预测HIV/AIDS患者体内病毒储存库大小中具有重要作用，其表达水平与病毒反弹及耐药存在联系[4]。此外，Edward[5]等证实，阻断PD-1可抑制慢性HIV感染的人源化小鼠的病毒复制。本研究通过RT-PCR法对HIV/AIDS患者PBMCs中PD-1 mRNA的表达进行研究，与健康人群相比，PD-1 mRNA的表达下降，结果表明HIV感染可诱导PD-1转录水平的下调。

T细胞过度活化是HIV感染进程中的重要特征，不能仅根据膜型分子的表达情况来判断患者的免疫状态[6]，因为研究显示，sPD-1参与T细胞活化的调控[7-10]。可溶性PD-1是由于PD-1的3号外显子缺失(PD-1 △ex3)[11]经翻译后形成的蛋白。据报道，sPD-1水平在类风湿性关节炎[12]、慢性肝炎[13]、系统性红斑狼疮[14]等病理状态下明显高于健康人群。本文研究结果表明，sPD-1水平未治疗组>治疗组>健康组，且CD4+T淋巴细胞数<350 个/mm3患者血清sPD-1水平均高于CD4+T淋巴细胞数>350 个/mm3患者(P=0.035、P=0.047)，高水平的sPD-1可对PD-1/PD-L1通路产生抑制。而抗病毒治疗一方面抑制病毒复制，另一方面通过下调sPD-1水平的机制来恢复PD-1/PD-L1通路，使患者免疫功能得以部分重建。从这个角度讲，使用可溶性PD-1的治疗可能较抗PD-1抗体更有优势[13]。

综上，本文通过RT-PCR法与ELISA法证明了PD-1在HIV/AIDS患者mRNA表达下调，而sPD-1表达上调，两者的变化表明其共同参与维持免疫系统平衡，为今后进一步研究PD-1 与HIV 感染的关系提供有价值的实验数据，也为PD-1靶向诊断和治疗HIV感染的策略提供了理论依据。

利益冲突：无

本文引用格式：陈琛, 赵长城, 王勇, 等. HIV/AIDS患者外周血程序性死亡受体-1的表达及临床意义[J]. 中国人兽共患病学报, 2019,35(4):320-323，329. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2692.2019.00.030