肠炎沙门菌YbjX基因缺失株的构建及生物学特性研究

苏硕青吴同垒王洪彬孔庆山赵 飞史秋梅张志强

沙门菌是一种重要的人兽共患病原菌，其造成的感染较为常见和多发，给畜禽生产以及人类健康带来重大威胁。在人上，沙门菌主要通过食源途径感染，引起腹泻、伤寒、甚至败血症，据世界卫生组织报告，当前世界范围内食源病原感染病例中，沙门菌占据第一位，年报告病例将近1 000万人，实际病例远超此数。在我国，沙门菌感染问题也不容忽视，近年来病例报道屡见不鲜[1]。

国外一项研究发现，人主要通过食源途径感染沙门菌，而受污染的食品中，禽蛋和禽肉等禽类产品占据相当大比重[2-3]。2010年，美国发生严重的沙门菌污染“毒鸡蛋”事件，近2000人感染发病，政府被迫召回5亿枚鸡蛋，造成了极为严重的经济损失[4]。

立足于沙门菌致病机制研究，并在此基础上提出科学的沙门菌防控策略，对人畜沙门菌感染防制具有重要意义。随着对沙门菌研究的不断深入，发现众多毒力因子和效应蛋白在沙门菌致病过程中发挥重要作用，这为沙门菌致病机制的完善乃至疫苗的开发提供了重要的理论参考[5]。我们前期研究中发现了大肠杆菌上外膜蛋白YbjX与细菌毒力关系密切[6]，而大肠杆菌和沙门菌YbjX基因高度同源，暗示其可能在沙门菌上同样有重要的作用，因此本研究以沙门菌YbjX蛋白为研究对象，通过同源重组方法缺失沙门菌上YbjX基因，并进一步评估沙门菌各菌株的生物学特性，解析YbjX蛋白在沙门菌感染致病中的重要作用。

1 材料与方法

1.1菌株、质粒与实验动物 禽肠炎沙门菌C50336参考菌株，pKD3、pKD46、pCP20以及pBR322质粒由扬州大学朱国强教授惠赠；6～8周龄清洁级昆明鼠，购自中国医学科学院实验动物研究所(北京，中国)，试验前在本实验室自由采食喂养1周。

LATaqDNA聚合酶、限制性内切酶及T4连接酶均购自TaKaRa(大连)；L-阿拉伯糖购自Sigma 公司；Minimal培养基按照配方配制，1L培养基需MgSO42 mmol/L、CaCl20.1 mmol/L、Na2PO47H2O 12.8 g、KH2PO43.0 g、NaCl 0.5 g、NH4Cl 1.0 g、葡萄糖4 g，所有试剂均购自天津市风船化学试剂科技有限公司。由河北科技师范学院动物传染病研究室制备并保存。

1.2λ-Red 同源重组引物的设计 根据NCBI上登录的肠炎沙门菌基因组序列(CP016754.1)设计缺失和鉴定引物(表1)，缺失引物P1、P2分别由两部分组成，其5′ 端部分与YbjX基因序列同源，3′端部分与质粒 pKD3氯霉素抗性基因 cat 两侧同源，P5、P6引物位于YbjX基因待敲除部分外侧，用于缺失株的鉴定；P3、P4引物用于扩增YbjX基因，构建回补质粒。所有引物由生工生物技术服务有限公司合成(表1)。

表1 文章中涉及引物

Tab.1 Primers used in this study

引物名称引物序列(5′-3′)扩增片段长度/bpP1TGTCGCGGATTACGATCATGACA-CAGCTTACAGATAATACCTGGTA-CACTTCAGATTACGTGTAGGCTG-GAGCTGCTTCG1 132P2GCTATCGAGTAACGCATAGCG-GCGGCGATACTCGGCCCGTTTCT-TACTGGCGATCTCCGCATAT-GAATATCCTCCTTAGP3CGGGATCC ATGTCGCGGAT-TACGATCATGACAC968P4ACGCGTCGACTTAACGTTTGAAT-GTGACCGGAACCP5ACAAACCTGACGCAATAAAGAT-AG1 106/1 307∗/377∗∗P6CGCCGCTGTTCAGAAAGATG

*为一次重组扩增片段大小，**为二次重组扩增片段大小

1.3肠炎沙门菌YbjX基因缺失株的构建 参照文献描述方法，将含有pKD46质粒的肠炎沙门菌C50336菌株接种于LB中，添加终浓度为30 mmol/L L-阿拉伯糖30 ℃诱导培养，待菌液OD600 nm达到0.4-0.6时，收集菌体，预冷10%甘油洗涤三次，制备电转化感受态。将P1、P2扩增纯化的打靶片段电转化到制备好的感受态细胞中，电转化条件为电压1.8 kV，脉冲25 μF，电阻200Ω挑取氯霉素抗性菌落进行鉴定。阳性菌落制备电转化感受态细胞，导入pCP20质粒，消除抗性标记，最终得到目的菌株(c50336ΔYbjX(KO)。基因缺失菌株利用PCR方法进行验证。

1.4回补菌株构建 以肠炎沙门菌基因组其为模板，利用P3、P4引物扩增YbjX基因片段(含启动子序列)，将其克隆到pBR322质粒上。将回补质粒pBR322-YbjX转化至c50336ΔYbjX突变菌株中，构建回补菌株c50336ΔYbjX/pBR322-YbjX(RC)。

1.5生长特性检测 分别将肠炎沙门菌野生型菌株、YbjX基因缺失株和回补菌株接种液体LB中，37 ℃振摇培养过夜，次日转接新鲜液体LB，初始浓度调整为106cfu/mL，37 ℃同步振摇培养；每隔2 h吸取菌液样品，测量600 nm处吸光度，重复上述试验3次，根据所得细菌数绘制生长速率曲线，比较两株细菌的生长速度。在Minimal培养基上重复该实验。

1.6生化特性测定 参照文献描述[7]方法利用梅里埃自动生化鉴定系统对C50336野生型菌株、YbjX基因缺失株进行生化特性比较。

1.7耐药性鉴定 参照NCCLS药敏试验标准，利用K-B纸片法对目的菌株进行药物敏感性测试，质控菌为大肠杆菌菌株ATCC25922。分别将肠炎沙门菌YbjX基因缺失株和野生型菌株接种液体LB中，37 ℃培养过夜。将过夜培养物调整至0.5个麦氏浊度，无菌棉签将细菌涂布于无抗生素的LB固体培养基上，并在培养基表面贴上药敏纸片，培养24 h测定药敏纸片的抑菌圈直径，以检测抗生素对该菌的抑制程度。试验重复三次，结果为测量平均值±标准差。

1.8肠炎沙门菌抗血清杀伤能力检测 参照文献描述方法[8]，将肠炎沙门菌各菌株与健康成年鸡血清共孵育，评估其抗血清杀伤能力，本研究主要评测补体对沙门菌的杀伤作用，用全菌ELISA未检测到血清中肠炎沙门菌抗体。计算细菌存活率(当前菌数/初始菌数)×100%。试验重复3次，实验数据统计采用prism 5.0软件分析。

1.9肠炎沙门菌抗蛋清杀伤能力检测 参照文献[9]方法，将肠炎沙门菌各菌株培养物稀释至2×103cfu/mL～4×103cfu/mL后加入1.5 mL蛋清液中充分混匀，于不同时间点取30 L涂布平板计数，记录不同孵育时间活菌数与初始活菌数之比，计算各菌株存活率。本研究所用蛋清取自SPF鸡胚，ELISA未检测到肠炎沙门菌抗体。

1.10巨噬细胞内存活能力测定 参照文献描述方法[11]，测定肠炎沙门菌各菌株在鼠源巨噬细胞Raw264.7内的存活和增殖情况，通过测定胞内增殖率(23 h菌数/3 h菌数)，评估各菌株在巨噬细胞内的存活能力。

1.11细菌致病力的测定 参照文献描述方法[11]，利用昆明鼠模型测定肠炎沙门菌各菌株的LD50，以评估各菌株的致病力。

2 结 果

2.1肠炎沙门菌c50336YbjX基因缺失株的构建

对肠炎沙门菌C50336进行缺失操作，获得一次重组菌株C50336ΔYbjX::cat和二次重组菌株C50336ΔYbjX。分别以野生型菌株、构建的一次重组株和二次重组株为模板，利用特异性鉴定引物扩增YbjX基因。结果显示，对照野生株扩增片段为1 100 bp，一次重组菌株和二次重组菌株扩增片段分别为1 300 bp和380 bp，与预期一致(图1)；进一步对二次重组菌株YbjX基因进行测序分析表明，经过二次重组，C50336ΔYbjX菌株YbjX基因中待缺失序列已被敲除。

M. DL2000 plus Marker; 1. C50336; 2. C50336YbjX::cat; 3. C50336ΔYbjX图1 肠炎沙门菌ΔYbjX基因缺失株的验证Fig.1 Identification of the knockout ofYbjX gene inSalmonella enteritidisstrains by PCR

2.2YbjX基因缺失对肠炎沙门菌生长特性的影响 测定肠炎沙门菌野生型菌株、YbjX基因缺失菌及回补菌株在普通LB(图2A)培养基和限制性培养基Minimal(图2B)中的生长情况，结果显示，3株菌生长速度无明显差异。

2.3YbjX基因缺失对肠炎沙门菌生化特性的影响 利用ATB全自动生化鉴定系统测定肠炎沙门菌c50336菌株与YbjX基因缺失株的生化反应谱，结果显示：二者生化反应谱无区别，均能利用葡糖糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露醇、柠檬酸盐，不能发酵蔗糖，它们的生化特性基本一致，说明YbjX基因缺失后不影响肠炎沙门菌的生化特性。

2.4肠炎沙门菌ΔYbjX 基因缺失株耐药性分析 药敏试验结果(见表2)表明，相较于野生型菌株，ΔYbjX基因缺失株对多种抗生素敏感增强，揭示YbjX基因缺失对肠炎沙门菌耐药性产生影响。

WT： C50336 野生型菌株KO： C50336ΔYbjX基因缺失菌株RS： C50336ΔYbjX/pBR322-YbjX回补菌株A：LB培养条件下生长曲线测定 B：Minimal 培养条件下生长曲线测定A：Growth curve in LB-medium; B： Growth curve in Minimal medium图2 肠炎沙门菌生长曲线测定Fig.2 Growth characteristics of C50336 isogenic deletion strains

表2 肠炎沙门菌C50336 ΔYbjX基因缺失株和野生型菌株的药敏试验结果

Tab.2 Resistance to antibotics ofSalmonellaC50336 ΔYbjX mutant and wild-type strains

抗生素抑菌圈直径/mmC50336C50336ΔYbjX多粘菌素B11.67±0.5815.33±0.58氨苄青霉素14.83±0.7621.67±0.58头孢拉定12.50±0.5017.33±0.29环丙沙星21.67±0.5830.67±1.53氯霉素16.50±0.5020.17±1.04卡那霉素11.67±0.5814.67±0.58四环素12.67±0.5819.67±0.58庆大霉素13.83±0.7613.67±0.58

重复三次药敏试验，结果为平均值±标准差

2.3YbjX基因缺失对肠炎沙门菌巨噬细胞内存活能力的影响 将肠炎沙门菌野生型菌株、YbjX基因缺失菌株和回补菌株等量感染鼠源巨噬细胞Raw264.7，测定3者在鼠源巨噬细胞内存活能力。结果显示，野生型细菌在Raw264.7细胞内的增殖率(23 h/3 h)达到40多倍，而对应的YbjX基因缺株在Raw264.7细胞内的增殖率(23 h/3 h)率约26倍(图3)，下降显著(P<0.05)。上述结果表明，YbjX蛋白参与调控肠炎沙门菌在巨噬细胞内的存活和增殖。

图3 YbjX基因缺失对肠炎沙门菌C50336在巨噬细胞Raw264.7胞内存活的影响Fig.3 Survival analysis of C50336 isogenic deletion strains by Raw264.7 cells

2.6YbjX基因缺失对肠炎沙门菌血清和蛋清生存的影响 将肠炎沙门菌野生型菌株、YbjX基因缺失株及回补菌株与健康鸡血清混合，评测其在血清中生存的影响，结果(图4A)显示，野生型菌株能够在鸡血清中很好的增殖，而YbjX基因缺失株生长速率远低于野生型菌株，回复菌株血清生存能力得到部分恢复。

进一步，我们检测了肠炎沙门菌各菌株在蛋清中存活能力。结果表明(图4B)YbjX基因缺失后肠炎沙门菌在蛋清内的存活能力显著下降，证明YbjX蛋白参与肠炎沙门菌的蛋内存活。

2.7YbjX基因缺失对肠炎沙门菌毒力的影响 利用小鼠模型测定肠炎沙门菌野生型菌株和YbjX基因缺失株的LD50，C50336和缺失菌株的LD50分别为3.98×105和1.43×107cfu，表明缺失株毒力显著下降，揭示YbjX基因与肠炎沙门菌毒力间的密切联系。

A：鸡血清存活实验； B：小鼠血清存活实验A, Survival assay in chicken serum; B, Survival assay in mouse serum图4 YbjX基因缺失对肠炎沙门菌血清生存的影响Fig.4 Serum survival assay ofS.enteritidisC50336 andYbjX-deficient mutant

3 讨 论

动物产品是人感染沙门菌的主要来源，从动物源头上严控沙门菌污染是预防人感染沙门菌的最有效手段。但事实上，这项工作还有许多问题有待解决。在畜牧生产上，沙门菌感染问题复杂且严重。沙门菌往往对幼龄动物造成严重疾病，引起幼龄动物腹泻、败血症，造成高淘汰率；而在成年动物则多为无症状感染，感染动物虽长期带菌，却不表现症状或症状轻微，特别是沙门菌可以垂直传播，这给沙门菌的诊断和防控带来极大困难[10]。深入研究沙门菌的致病机制，对于探索沙门菌感染防控的新技术具有重要意义。YbjX是存在于革兰氏阴性细菌表面的外膜蛋白，在耶尔森菌上的一项研究表明，YbjX蛋白的表达受双组份调控系统PhoP/Q所调控，而该系统参与细菌毒力的调控[11]。前期在大肠杆菌上的一项研究发现，YbjX与细菌的致病性密切相关[6]，那么YbjX是否参与沙门菌的致病过程？发挥何种作用？为了回答这些问题，本研究构建了肠炎沙门菌YbjX基因缺失菌株和回补菌株，并进一步分析其生物学特性。我们发现，YbjX蛋白失活后，肠炎沙门菌的生长和生化特性并无明显变化，表明该蛋白并不参与细菌的基础代谢过程。作为典型的胞内致病菌，沙门菌胞内存活特别是巨噬细胞内存活能力对于其感染致病至关重要，是沙门菌长期存活难以根除的重要原因[12]。本研究中，我们发现将YbjX蛋白失活后，肠炎沙门菌在巨噬细胞内的存活能力大幅下降，揭示其可能在沙门菌宿主内存活过程中发挥重要作用。败血性细菌能够抵御宿主血清杀伤造成系统感染[11]，沙门菌亦可引发败血症，本研究发现YbjX基因缺失后，沙门菌在血清中增殖能力被大幅度削弱，造成败血感染的能力有所下降。蛋清中的溶菌酶和转铁蛋白等杀菌物质能够对细菌进行杀伤，而在长期的进化过程中，沙门菌能够抵御蛋清杀伤从而得以在蛋内长期存活，这是其造成垂直传播以及食品安全隐患的重要原因，本研究中我们发现，YbjX基因缺失后，沙门菌在蛋清内的存活能力显著下降，这与前人的报道一致。前期研究发现YbjX与细菌对抗β防御素过程中发挥关键作用[11]，进一步研究表明，YbjX参与细菌对抗多粘菌素B的杀伤[4]，本研究也证实了这一点，且进一步的我们发现YbjX参与细菌对抗多种抗生素，其机制有待于进一步挖掘。基于上述研究结果，我们认为YbjX可能参与沙门菌多种生命进程，并与其致病性相关。因此，我们进一步利用小鼠模型评估YbjX基因缺失肠炎沙门菌致病性的影响，如我们所预期的，YbjX基因缺失后肠炎沙门菌对小鼠致病力显著下降。

综上所述，我们认为外膜蛋白YbjX与肠炎沙门菌的胞内存活、抗生素耐受性以及细菌毒力密切相关，在沙门菌的致病过程中发挥重要作用。本项研究为沙门菌致病机制研究和疫苗的开发奠定基础。

利益冲突：无

本文引用格式：李永慧, 苏硕青, 吴同垒, 等. 肠炎沙门菌YbjX基因缺失株的构建及生物学特性研究[J]. 中国人兽共患病学报, 2019,35(4): 324-329. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2692.2019.00.031