灰黄霉素超饱和体系及其共晶的跨膜渗透性研究

胡志远 ， 陈莹娴 ， 刘晓慧 ， 王凯茹 ， 朱明强 ， 刘 静 ， 赵兴华 ， 何 欣

(1.河北农业大学动物医学院 ， 河北 保定 071000 ; 2.河北保定海关 ， 河北 保定 071001)

灰黄霉素(Griseofulvin, Gri) 是1939年从青霉菌(Penicilliumspp.)培养液中得到的一种含氯代谢产物，用于治疗皮肤真菌病，对毛发癣菌、小孢子菌、表皮癣菌等浅部真菌有良好的抗菌作用[1]。灰黄霉素在生物药剂学分类系统(Biopharmaceutics classification system, BCS)中属于低溶解性高渗透性的Ⅱ类药物[2]，口服生物利用度由药物在胃肠道中的溶解度决定，由于灰黄霉素的溶解度极低，其在胃肠道中的溶解速率很小，口服生物利用度低，大大限制了其临床应用。增加BCSⅡ类药物的溶解度和溶出度是科研工作者所面临的重要挑战之一。目前，通常采用包括纳米技术、水溶性载体、微粉化技术、无定形体、溶剂化物、固体分散体等技术提高难溶性药物的溶解度，但是这些方法都有其应用的局限性[3-4]，例如，纳米混悬和固体分散技术存在稳定性差，制剂在放置过程中会出现溶出速率下降的问题。共晶是指药物分子与共晶形成物以一定的比例，通过分子间非共价相互作用力形成的晶体。通过将药物制备成共晶可以改变药物的流动性、稳定性、溶解度和溶出速率甚至口感。

羟丙甲纤维素醋酸琥珀酸酯(Hydroxypropylcellulose acetate succinate, HPMCAS-HF)是羟丙甲纤维素的醋酸酯和琥珀酸酯混合物，有研究显示，该纤维素类聚合物具有最优良的抑制药物结晶的效应[5-6]。本研究在制备灰黄霉素共晶的基础上，通过对添加HPMCAS-HF的灰黄霉素液态超饱和溶液、灰黄霉素-安赛蜜共晶以及灰黄霉素粉末的跨膜渗透性进行比较分析，为研究灰黄霉素的药动学提供科学依据。

1 材料与设备

灰黄霉素(Griseofulvin，Gri)：广东台城制药有限公司；安赛蜜钾(Acesulfame potassium，AceK)：Tokyo Chemistry Industry co., Ltd., Japan；羟丙甲纤维素醋酸琥珀酸酯(HPMCAS-HF)：大连业建贸易有限公司；X-射线衍射仪：Bruker Axsinc, Madison, Wisconsin；紫外-可见光分光光度计：UV-2450，Shimadzu，Japan；HC-188透皮扩散仪：天津市正通科技有限公司；透析膜(截留分子量为8 000-14 000)：用10%的NaHCO3，70 ℃水浴20 min以除去硫化物；10 mM的EDTA 70 ℃ 水浴20 min以除去重金属；去离子水70 ℃ 水浴20 min以除去甘油；其他试剂均为分析纯。

2 试验方法

2.1 灰黄霉素紫外分光光度计测定标准曲线的建立 按照文献[7]的方法建立灰黄霉素的紫外分光光度计的测定方法。

2.2 共晶的制备 利用离子交换法[8]制备灰黄霉素-安赛蜜共晶。称取灰黄霉素7.1 g和安赛蜜钾4.02 g加入到甲醇和水的水溶液中，加入适量的盐酸，磁力搅拌器搅拌24 h，取滤渣放置于60 ℃烘箱中干燥6 h。

2.3 灰黄霉素-安赛蜜共晶的X射线衍射表征 分别取灰黄霉素和灰黄霉素-安赛蜜共晶样品适量，将样品平铺，电压45 kv，电流40 mA，扫描步长0.02°，以0.02°/s的速度在 (5°～35°)扫描，绘制X射线衍射图。

2.4 灰黄霉素以及灰黄霉素-安赛蜜共晶的HPMCAS-HF溶液的配制 配置适当浓度的HPMCAS-HF溶液。将适量的灰黄霉素和灰黄霉素-安赛蜜共晶溶解在上述溶液中以达到最大的浓度。

2.5 溶液的平衡溶解度的测定 分别选取灰黄霉素原料药和灰黄霉素-安赛蜜共晶样品适量，加入到10 mL水中和HPMCAS-HF的缓冲溶液中，密封，37 ℃，溶液在过饱和状态下搅拌72 h，溶液达到平衡后，10 000 r/min离心15 min取上清液，取滤液用紫外分光光度计测定浓度。

2.6 体外扩散率的测定 利用Fran’z扩散池进行药物的体外扩散试验。池口的有效扩散面积为0.785 cm2，上下两个半池分别为扩散池和接受池，接受池的容积为5 mL。将10、8、5、2 μg/mL的灰黄霉素水溶液和165 μg/mL、82.5 μg/mL、55.27 μg/mL的灰黄霉素的0.1%的HPMCAS-HF溶液以及14 μg/mL灰黄霉素-安赛蜜共晶水溶液，65.60 μg/mL共晶的HPMCAS-HF溶液加入Fran’z透皮仪的样品池，接收液为去离子水。在接受池和扩散池中间移入处理好的透析膜，夹紧后接受池中加入去离子水，扩散池中加入待试药液2.5 mL。然后置于(37±0.03)℃的循环水浴中，接受池转子搅拌速度为400 r/min，加入样品后，分别于设定的时间间隔：30、45、60、90、120、180、240、300、360 min 由取样口取1 mL接受液，同时补充等体积的去离子水。将不同时间取出的接受液样品用上述方法进行吸光度的测定，代入回归方程[9]。并计算稳态渗透速率。

式中：C是接受液的校正浓度(μmol/L)，Cn是第n个取样点接受液样品的实测浓度(μg/mL)，∑Ci是第n个取样点前实测浓度之和，V 是接受室体积(即5 mL)，V0是每次取样的体积(即1 mL)。

体外渗透速率按Fick’s 扩散方程(2)计算： Jss=V/A×dc/dt(2)

式中：Jss是稳态渗透速率(μg/cm2·h)，V是接受室体积(即5 mL)，A 是皮肤有效扩散面积(即3.14×0.52cm2)，c 是接受室的校正浓度(μg/mL)，t是时间(h)，dc/dt是接受液浓度与时间曲线的直线部分的斜率。

3 结果与分析

3.1 灰黄霉素标准曲线的绘制 选用292 nm 为测定波长，经回归得标准曲线方程为y=0.097X+0.007 6，R2=0.999 9。在0～20 μg/mL范围内线性关系良好。如下表1和图1。

表1 不同浓度灰黄霉素的吸光度

图1 灰黄霉素的紫外标准曲线

3.2 灰黄霉素的平衡溶解度 如表2所示，灰黄霉素添加聚合物之后可以显著提高灰黄霉素的溶解度。灰黄霉素-安赛蜜共晶的溶解度在添加聚合物HPMCAS-HF之后也有显著提高。

表2 不同灰黄霉素溶液的溶解度 (37 ℃)

3.3 灰黄霉素-安赛蜜共晶的X射线衍射图 试验样品的X射线衍射(PXRD)分析结果如中插彩版图2所示，利用离子交换法制备的灰黄霉素-安赛蜜共晶与文献中利用研磨法制备的共晶出现了相同的PXRD谱图的特征峰，用研磨的方法(AceH gri G)和溶剂法(AceH gri S 和AceK gri S)制备的灰黄霉素-安赛蜜共晶的PXRD图与文献报道(paper data)的一致[7]。

图2 灰黄霉素-安赛蜜共晶的PXRD图

图3 超饱和灰黄霉素的跨膜渗透曲线

图4 低于饱和溶解度时灰黄霉素的跨膜渗透曲线

图5 灰黄霉素添加聚合物前后的跨膜渗透曲线

3.4 灰黄霉素的扩膜渗透性及稳态渗透速率 不同物质跨膜渗透的稳态渗透速率如下表3。由中插彩版图3-5跨膜渗透曲线和表3的稳态渗透速率数据可以看出，低于灰黄霉素饱和溶解度的样品的跨膜渗透速率均较低(中插彩版图4)，其中5 μg/mL和10 μg/mL的跨膜渗透速率只有0.006 37 μg/cm2·h。制备的灰黄霉素-安赛蜜共晶在一定程度上增加了药物的溶解度，其在HPMCAS-HF中的溶解度也有提高，稳态渗透速率也相应地提高了(中插彩版图5)。但是灰黄霉素在HPMCAS-HF中处于超饱和状态时，具有最高的稳态渗透速率(中插彩版图4)，为0.153 μg/cm2·h，比灰黄霉素在水中提高了12倍，比灰黄霉素共晶在水中提高了11.7倍，比灰黄霉素共晶在HPMCAS-HF中提高了2倍。

表3 不同物质跨膜渗透的稳态渗透速率

4 讨论

药物制剂技术的发展提高了新药开发的成功率，许多药物存在诸如水溶性差和生物利用度低等缺点，研究人员常借助于制备药物的无定形态以改善药物的溶解度和溶出速度，但无定形态药物在水溶液中能否形成超饱和溶液是其提高溶解性的关键。从热力学角度来说，从超饱和溶液中获得的溶解度的提升与添加诸如表面活性剂的提升是不一样的。超饱和溶液的化学能和热力学性质比饱和溶液和亚饱和溶液的要高。添加物增加浓度是增加平衡溶解度而不是增加化学势能。例如将药物添加在含有表面活性剂的微团中，可以增加溶解度，但不增加“自由药物”的量。自由药物的数量与溶液的热力学活性有关，这个参数还决定跨膜的程度。这个区别很重要，因为这样的超饱和溶液就可以增加物质的跨膜转运能力[10-11]。另外，超饱和溶液会形成一个非结晶的药物富集相。聚合物与无定形态结合形成的固态分散体也是借助于聚合物能够维持其稳定性的作用，特别是在溶液中形成超饱和的能力。无定型的固体分散体由于具有较高的溶解度和溶出速率而出现超饱和溶液，一定量的聚合物可以通过抑制结晶的形成而使这个药物富集相以纳米级的框架形成[12-13]，从而增加药物的跨膜转运。

本试验以灰黄霉素为例，此前已有文献报道了它的无定形态在水溶液中会发生快速结晶而导致它失去超饱和的优势，测得无定形态与结晶态的溶出速度没有提高，另外制得的共晶能够达到药物最大浓度的3倍左右，但共晶在水溶液中也存在着药物分子去饱和析出的问题，即也无法维持药物的超饱和状态。Lynne等[14]证实了在众多聚合物中，HPMC-AS-HF是一种能够有效的结晶抑制剂，在本试验中我们首先通过离子置换法制得了高浓度的灰黄霉素溶液，试验结果表明，加入0.1%的HPMC-AS-HF能够长时间维持溶液中灰黄霉素的浓度至165 μg/mL，这一超饱和溶液长时间维持了药物较高的跨膜渗透速率，灰黄霉素的HPMCAS-HF的超饱和溶液的渗透速率为0.153 μg/cm2/h，远远高于灰黄霉素原液的渗透速率，大约是其12.05倍。表明这一方法极为有效的提高了溶液中药物的游离态浓度，这一方法较加入β环糊精、表面活性剂和PEG等助溶手段而言具有较大优势，因为一般的助溶手段均不能增加游离态药物的浓度，因此常常出现药物表观浓度增加但跨膜渗透速度并未发生变化。在本研究中，共晶的制备并没有增加药物的渗透性，但是添加聚合物之后的共晶溶液的渗透性却有了显著的增加。这为本课题组将进行灰黄霉素、灰黄霉素共晶以及灰黄霉素的聚合物溶液的生物利用度研究，提供了重要的理论依据。