螺内酯对代谢综合征大鼠主动脉重构的作用

代谢综合征(MS)是指多种代谢异常簇集发生在同一个体的临床状态。这些代谢异常包括糖耐量减低、中心性肥胖、脂代谢紊乱、高血压及心脑血管疾病。流行病学调查和基础研究证实，MS可引起血管内皮功能障碍和动脉粥样硬化等血管损伤性疾病，最终导致血管重构[1]。MS诱导的主动脉重构与高血脂、胰岛素抵抗及高血压等相关，分子机制涉及炎性反应、血管活性肽及脂肪细胞因子等。醛固酮是促组织纤维化的活性因子，与心血管重构关系密切。醛固酮与盐皮质激素受体结合后发挥效应，但是否参与MS诱导的主动脉重构尚不清楚。本研究通过建立MS大鼠模型诱导主动脉重构，探讨醛固酮和受体的表达情况及醛固酮拮抗剂螺内酯对主动脉重构的作用。

1 材料与方法

1.1 试剂、仪器及动物

高果糖饲料购自北京华阜康生物科技有限公司；醛固酮放射免疫试剂盒购自北京华英生物研究所；盐皮质激素受体一抗购自北京博奥森生物技术有限公司，二抗及二甲氨基偶氮苯(DAB)显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。血糖试纸及快速血糖仪购自美国雅培公司；鼠尾动脉无创测压仪由汕头大学医学院动物实验中心提供； Beckman Coulter AU5800生化仪由汕头大学医学院第一附属医院检验科提供。雄性SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 MS动物模型制备

取雄性SD大鼠8只作为正常对照组，普通饲料喂养。另取雄性SD大鼠16只作为MS模型组，用高果糖饲料喂养10周，采用鼠尾动脉测压仪测量血压，禁食8 h后尾动脉取血，快速血糖仪检测血糖，Beckman Coulter AU5800生化仪检测血清三酰甘油水平，以确定MS模型是否成功建立。将建模成功的MS大鼠随机分成MS组(n=8)和MS+螺内酯组(n=8)，继续高果糖喂养，MS+螺内酯组每天予螺内酯40 mg/kg灌胃1次。4周后称重，3%水合氯醛麻醉，从大鼠心脏取血，EDTA抗凝，4 ℃离心分离血浆，-80 ℃冰箱保存，迅速分离大鼠胸腹主动脉，保存备用。

1.3 主动脉组织胶原纤维Masson染色

取大鼠胸主动脉段，用冰生理盐水洗净残余血液，4%多聚甲醛固定，脱水，石蜡包埋，制作4 μm厚连续切片，常规脱蜡、水化、脱水后，进行Masson染色。光镜下观察和照相，进行图像分析。

1.4 血浆和主动脉醛固酮水平的测定

取大鼠血浆和主动脉组织，制备匀浆后，吸取上清液，用考马斯亮蓝法进行蛋白定量，按照醛固酮放射免疫试剂盒说明书的步骤，采用放射免疫法测定大鼠血浆和主动脉组织中醛固酮的水平。

1.5 免疫组织化学染色法检测主动脉组织盐皮质激素受体的表达

取大鼠胸主动脉组织切片，常规脱腊入水，抗原修复，封闭非特异性抗原，加入盐皮质激素受体一抗孵育过夜，加入二抗孵育30 min，DAB显色，苏木素复染，盐酸酒精分化、脱水、透明后，中性树胶封片，光镜下观察。

1.6 统计学分析

采用GraphPad Prism 4统计软件进行数据处理及统计学分析。计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MS大鼠模型特征

使用高果糖饲料喂养大鼠10周后，MS模型组平均动脉压、血糖、三酰甘油水平明显高于正常对照组，提示建模成功。见表1。

表1 两组大鼠平均动脉压、血糖、血脂比较

注：与正常对照组比较，(1)P<0.01

2.2 大鼠主动脉Masson染色

采用Masson染色法观察大鼠主动脉组织，与正常对照组相比，MS组大鼠主动脉全层均有明显的胶原蛋白沉积，血管细胞和弹力纤维排列紊乱，管壁增厚。MS+螺内酯组血管胶原沉积有所改善。见图1。

注：A为正常对照组；B为MS组；C为MS+螺内酯组；蓝色为胶原纤维

2.3 大鼠血浆和主动脉组织醛固酮水平的变化

MS组主动脉组织醛固酮的表达水平较正常对照组明显升高，MS+螺内酯组醛固酮表达水平较MS组明显降低(P均<0.01)；3组血浆醛固酮水平无统计学差异，见表2。

表2 3组大鼠血浆和主动脉组织醛固酮水平比较

注：与正常对照组比较，(1)P<0.01；与MS组比较，(2)P<0.01

2.4 大鼠主动脉组织盐皮质激素受体表达水平的变化

MS组主动脉组织盐皮质激素受体表达水平较正常对照组升高，MS+螺内酯组主动脉组织盐皮质激素受体表达水平较MS组有所下降，见图2。

3 讨论

MS与心血管疾病密切相关，是目前心血管领域研究的热点之一。研究发现，MS大鼠模型可出现主动脉重构，表现为血管内膜及中膜不均一增厚，结构紊乱，平滑肌细胞增殖明显[2-4]。研究参与MS主动脉重构的因子，有利于揭示主动脉重构的分子机制，并为其防治提供新的临床策略。

注：A为正常对照组；B为MS组；C为MS+螺内酯组；棕黄色为阳性表达

醛固酮是肾素-血管肾张素-醛固酮系统(RASS)的终末激素，也是体内重要的盐皮质类固醇激素。醛固酮主要通过经典的血管紧张素转换酶途径产生，也可由心血管系统通过自分泌、旁分泌等方式产生。心血管系统醛固酮的作用不受血浆醛固酮水平的影响，可以单独作用于血管壁、心肌，引起炎性反应、纤维化、胶原沉积、钙化等，因此醛固酮在心血管重构中起着重要作用[5-7]。本研究采用高果糖饲料喂养大鼠，其血压、血糖及三酰甘油明显升高，成功建立了MS大鼠模型。Masson染色结果显示，MS大鼠主动脉全程均有明显的胶原蛋白沉积，内皮细胞及弹力纤维排列紊乱，提示存在主动脉重构，这与国内外学者的研究一致[3]。同时，主动脉中醛固酮与其受体表达明显增加，用醛固酮拮抗剂螺内酯干预，可改善主动脉重构。而3组大鼠血浆醛固酮水平无明显差异，提示醛固酮/盐皮质激素受体系统可能参与了MS大鼠的主动脉重构，并且通过自分泌或旁分泌的方式发挥作用。

醛固酮可使细胞间黏附分子-1、单核细胞趋化蛋白-1和肿瘤坏死因子-α等的表达增加，引起心血管系统周围炎性反应，并促进血管组织纤维化和钙化的发生，而醛固酮拮抗剂能降低炎性因子的表达，延缓心肌和血管的损伤。另外，醛固酮可通过增强氧化应激损伤内皮功能，外源性醛固酮还可增强还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶的活性，减少一氧化氮的合成，抑制一氧化氮依赖的血管舒张，应用醛固酮拮抗剂可以改善一氧化氮依赖的血管舒张[8-10]。因此，醛固酮与血管纤维化、血管钙化等血管重构事件的发生密切相关。本课题组在血管钙化动物模型中发现醛固酮可促进血管钙化，外源性醛固酮可促进大鼠主动脉组织纤维化[10-11]。在病理状态下，局部组织醛固酮水平增加，醛固酮通过与盐皮质激素受体结合，激活Rho激酶等信号转导通路[12-13]，促使炎性反应、氧化应激的发生，刺激血管细胞增殖，胶原沉积，促进血管重构的发生发展。

醛固酮主要有调节体内钠、钾离子平衡的作用，随着研究的不断深入，学者们发现醛固酮还是促纤维化、促炎性反应、促血管钙化的重要因子。本研究发现MS大鼠存在主动脉重构，主动脉中醛固酮和盐皮质激素受体的表达明显增加，提示醛固酮和盐皮质激素受体参与了主动脉重构，用螺内酯干预可明显改善该过程。后续研究需进一步探讨醛固酮和盐皮质激素受体参与主动脉重构内在的信号转导途径。