二叶式主动脉瓣钙化发病机制及相关蛋白的研究进展

二叶式主动脉瓣(BAV)是人类常见的先天性心脏病，发病率为0.5%～2%，其中20%～50%的患者因发展为重度主动脉瓣狭窄而行主动脉瓣置换术[1]。BAV导致的BAV钙化(BAVC)通常合并主动脉病变，晚期易发生升主动脉瘤或主动脉夹层等危及生命的并发症[2-3]。过去认为主动脉瓣钙化是一种退行性病变，由钙盐在瓣膜表面被动沉积导致。然而，也有研究表明，主动脉瓣钙化是一个活跃的病理生理过程，具有较强的遗传特性，其机制与成骨机制相似[4-5]。影响瓣膜钙化的因素多种多样，包括氧化应激、细胞增生、成骨作用、细胞炎性反应、细胞凋亡和坏死等[6]。BAVC的发病机制目前尚未明确。

正常主动脉瓣包括纤维层(fibrosa)、松质层(spongiosa)、心室基层(ventricularis)。瓣膜内皮细胞(VEC)位于瓣膜血液接触面，调节瓣膜的通透性、炎性细胞的黏附和旁分泌信号。主动脉瓣间质细胞(AVIC)分布于主动脉瓣各瓣膜层，是瓣膜主要的细胞类型。AVIC是瓣膜重构的关键，调节细胞外基质(ECM)的合成和降解[7]。从瓣膜形态上看，钙化瓣叶纤维层增厚，纤维膜附近钙化结节形成[8](见图1)。电镜下可见瓣膜钙化组织与骨组织相似，其主要成分为羟基磷灰石结晶[9]，其钙化程度可通过冯科萨染色判断(见图2)。

1 BAVC相关蛋白

1.1 骨形态发生蛋白(BMP)

BMP-2、BMP-4是主动脉瓣钙化的重要调节因子。BMP-2的下游因子如runt相关转录因子2(RunX2)，与α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)一起作为肌成纤维细胞和成骨细胞的分化标记物，参与调控成纤维细胞分化和骨形成[6,10]。Gomez-Stallons等[11]在对培养了6周的Klotho-/-基因敲除小鼠的研究中发现，实验组主动脉瓣钙化结节区有BMP-2高表达，而无明显钙化的对照组中主动脉瓣未见明显BMP-2表达。此外，Klotho-/-实验组中BMP-2、BMP-4配体基因表达也较对照组增加。Zeng等[12]通过抑制白细胞介素-37的表达，发现人AVIC钙化沉积明显加重，同时BMP-2和碱性磷酸酶(ALP)表达增加。Sun等[6]在研究剪切应力对瓣膜钙化影响的实验中发现，剪切应力增加的BAV实验组较对照组BMP-4水平增加2.4倍。Yanagawa等[13]发现BAV钙化组BMP-2及α-SMA的表达水平较对照组显著升高，并且RunX2表达水平也相对升高，这进一步证明了BMP-2和BMP-4与BAVC相关。

注：A为非钙化组织；B为钙化组织；图片来自中南大学湘雅二医院心脏中心

图1 二叶式主动脉瓣

注：A为非钙化组织；B为钙化组织；图片来自中南大学湘雅二医院心脏中心

图2 主动脉瓣组织的冯科萨染色

1.2 基质金属蛋白酶(MMP)

MMP是一种锌离子依赖性明胶酶，在ECM降解及重构过程中有重要作用，并受其活化程度、基因表达水平以及金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)共同调节[14]。有研究表明，MMP如MMP-2、MMP-9、MMP-12的升高与主动脉瓣钙化有关。Sun等[6]研究显示，剪切应力增加的BAV实验组中MMP-2和MMP-9的表达水平较对照组明显升高。Jung等[15]给4～5周的ApoE-/-基因敲除小鼠分别喂饲高脂饮食3、6、9个月后，小鼠主动脉瓣钙化发生率分别为0%、17%、50%；通过RP805示踪剂特异性激活MMP，并应用显微SPECT及增强CT间接测量MMP活化水平，结果发现MMP活化及MMP-12表达水平6个月组>9个月组>3个月组，这提示MMP活化水平可能与主动脉瓣钙化有关，但并不呈线性正相关发展。Du等[10]通过冯科萨染色选取钙化沉积相当的BAV、风湿性三叶主动脉瓣(RTV)及退行性变三叶主动脉瓣(DTV)，免疫组织化学染色显示BAV组中MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平较RTV、DTV组显著升高，天狼星红染色显示BAV较RTV和DTV组织有更多的胶原蛋白表达。由此说明MMP在主动脉瓣钙化过程中起重要作用，且在BAVC中更为突出。

1.3 Smad蛋白家族

Smad蛋白家族是一类细胞内信号传导蛋白。多项研究表明，Smad蛋白磷酸化与瓣膜钙化相关，并能直接参与转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员的信号传导[10-11,16-17]。Ankeny等[16]研究发现,人类主动脉瓣钙化区内出现了磷酸化Smad1/5/8 (pSmad1/5/8)的高表达，表明pSmad1/5/8水平与主动脉瓣钙化有关。Du等[10]研究发现，BAV与RTV、DTV相比，微小RNA(miRNA)-195表达水平降低，而Smad7表达水平升高；并且miR-195可以直接作用于Smad7，进而调节瓣膜钙化水平。这提示Smad蛋白可能对BAVC有促进作用。

1.4 Sox9蛋白

Sox9是软骨形成的主要调节因子，参与软骨细胞增殖、分化和成熟过程[18]。Peacock等[19]研究发现，Sox9缺陷小鼠可出现心脏瓣膜钙化，而体外敲除Sox9可导致RunX2表达增加和钙沉积，说明Sox9有抑制瓣膜钙化的作用。但Li等[18]用高浓度磷酸盐体外培养人AVIC，发现RunX2和ALP表达增加，AVIC长时间接触磷酸盐会导致钙沉积，敲除Sox9可减弱人AVIC中磷酸盐诱导的高钙沉积，并促使RunX2和ALP表达下调。Sox9在小鼠及人瓣膜钙化的进展中作用不一，可能与不同种属间钙化机制存在差异有关。

1.5 羧基谷氨酸蛋白(MGP)

MGP是一种维生素K依赖蛋白，以两种不同的形式存在：非羧化活性(ucMGP)和羧化活性(cMGP)。与所有维生素K依赖蛋白一样，MGP需要维生素K诱导其羧基化来发挥作用。MGP主要通过抑制BMP表达以及与羟基磷灰石直接作用这两条途径来阻止钙化进程[20]。Chiyoya等[21]使用30 ng/mL肿瘤坏死因子-α (TNF-α)体外诱导人AVIC，发现实验组细胞钙化程度加重，并出现MGP低表达和BMP表达上调，进一步敲除MGP基因可以显著诱导钙化，并引起BMP基因表达升高。由此说明MGP可以通过特异性抑制BMP表达，延缓主动脉瓣膜钙化进程，但其是否可以同样抑制BAVC中BMP表达，需进一步验证。

1.6 一氧化氮合酶(NOS)

一氧化氮(NO)由内皮细胞分泌，在许多生理和病理过程中起着关键作用，并与主动脉瓣钙化过程有关[3]。Kim等[22]研究发现，与正常三叶主动脉瓣膜(TAV)组相比，BAV组75%的患者存在内皮源性NOS(eNOS)、TIMP-2表达下调，而MMP-9表达上调。El Accaoui等[23]在对eNOS-/-小鼠的研究中发现，eNOS表达下降更容易导致BAVC，进而证实NOS与BAVC相关。

1.7 成骨生物标志蛋白

骨桥蛋白(OPN)、ALP以及RunX2是成骨细胞的标志物，大量研究证明其与瓣膜钙化相关，并作为瓣膜早期钙化的标志物，在BAVC中高表达[12,17,24-26]。Song等[17]发现，抑制TGF-β1和BMP-2活性可降低ALP、OPN、RunX2的表达水平，抑制钙沉积，提示ALP、OPN、RunX2与瓣膜钙化相关，并受TGF-β1和BMP-2调控。

2 蛋白相关信号通路

2.1 Notch信号通路

Notch1信号通路是参与细胞生长、细胞分化和心脏瓣膜形成的高度保守信号通路。在常染色体显性遗传家系中，Notch1突变是引起BAV的重要原因，Garg等[3]研究认为，Notch信号通路的丢失可通过RunX2、Sox9和BMP-2依赖机制导致主动脉瓣钙化。Nus等[24]使用γ分泌酶抑制剂DAPT抑制猪AVIC的Notch信号表达，通过茜素红染色发现DAPT组钙化结节较空白对照组增加2倍，同时BMP-2、RunX2、ALP均表达上升。Irtyuga等[5]研究发现，钙化狭窄的BAV/TAV患者血清中骨保护蛋白(OPG)显著高于对照组，且可溶性核因子κB受体激动剂配体(sRANKL)仅在BAV组中明显升高。此外，Notch1突变组OPG表达上调，OPG/RANKL比值也明显升高，由此推测Notch1可能通过OPG/RANKL/RANK信号通路促进瓣膜钙化。也有研究结果与之相反，Zeng等[25]在对人AVIC的研究中发现，加入NICD1抑制剂DAPT的实验组BMP-2、ALP的表达水平较对照组降低，更重要的是细胞内钙盐沉积程度减轻。Kostina等[26]从人BAVC、钙化TAV以及非钙化TAV中分离培养AVIC,发现BAVC患者的AVIC对早期成骨分化刺激的敏感性明显高于其他两组，对Notch信号引起的OPN、ALP表达活化也更为敏感。Notch在不同种属、不同个体中作用各异，可能与其复杂的遗传信息相关，因此Notch在BAVC中的具体分子机制有待进一步研究。

2.2 TGF-β超家族信号通路

2.2.1 BMP信号通路 BMP-2是目前研究最多、诱导成骨分化及促进骨形成作用最强的细胞外信号分子之一，其主要通过BMP-2/RunX2信号通路参与成骨分化，BMP-2与其受体结合后可以激活细胞外信号调节激酶1/2 (ERK1/2)或Smads复合物，正向调节RunX2，再激活下游osterix基因，促进骨形成及成骨分化。Yanagawa等[13]认为AVIC的上游活化剂如TGF-β可以触发BMP-2进而激活ERK1/2，从而正向调节RunX2,导致钙化和主动脉瓣狭窄。Song等[17]使用双糖链蛋白多糖诱导AVIC后，发现ALP、OPN和RunX2的表达较对照组显著增加，BMP-2拮抗剂降低了其诱导的ALP、OPN和RunX2的蛋白水平，由此证明BMP-2在主动脉瓣钙化中起关键作用。进一步敲除Smad1基因，发现双糖链蛋白多糖诱导的ALP、骨桥蛋白和RunX2的蛋白水平较前下降，提示BMP-2可以通过激活Smad1正向调节RunX2，从而促进骨形成及成骨分化，导致瓣膜钙化。

2.2.2 TGF-β信号通路 研究证明，TGF-β1和TGF-β3与主动脉瓣钙化相关，但其作用有所不同[10,27-28]。Miller等[27]在AVIC体外培养实验中发现，TGF-β1可以诱导细胞凋亡、细胞聚集和钙化结节形成。Du等[10]通过10 ng/mL TGF-β体外诱导AVIC，发现TGF-β组钙化水平较对照组提高3.9倍。Song等[17]在双糖链蛋白多糖诱导的AVIC实验中也证实了TGF-β1在主动脉瓣钙化中的关键作用，进一步敲除Smad3基因，其诱导的ALP、OPN和RunX2的表达水平较前下降，表明TGF-β1可以通过激活Smad3正向调节RunX2，从而促进骨形成及成骨分化，导致瓣膜钙化。Fang等[28]则在AVIC实验中发现，抑制miR-29b基因可上调TGF-β3及下调Wnt3/β-catenin/Smad3的表达，由此证明miR-29b可通过抑制靶标TGF-β3的表达导致瓣膜钙化。

2.2.3 活化素蛋白激酶2(ALK2)信号通路 ALK2属于TGF-β超级家族的Ⅰ型受体成员之一。Thomas等[29]在对ALK2基因敲除小鼠的研究中发现，ALK2基因缺失更容易导致BAV及主动脉瓣狭窄，虽未使瓣膜出现明显钙化，但可诱导细胞增殖，同时可导致ERK1/2磷酸化水平增加，促进成骨因子的表达，由此说明ALK2可能在BAVC过程中起作用。

2.2.4 骨形态发成蛋白受体IA(BMPR-IA)通路 BMPR-IA是TGF-β超家族成员之一。研究显示，BMPR-IA与瓣膜钙化相关。Gomez-Stallons等[11]在Klotho-/-小鼠中发现，BMPR-IA失活可以导致主动脉瓣钙化减轻，pSmad1/5/8表达下降，提示在Klotho-/-小鼠中BMP-pSmad1/5/8信号通路对主动脉瓣钙化起重要作用。此外，在猪AVIC的体外实验中发现，LDN-193189(BMPR-IA抑制剂)处理可以显著抑制pSmads1/5/8表达，这进一步表明BMPR-IA通过pSmad1/5/8调节下游成骨因子，导致瓣膜钙化。

2.3 ERK1/2信号通路

只有磷酸化的ERK1/2才具有活性并与瓣膜钙化有关。Zeng等[25]在人类的AVIC体外试验中发现，脂多糖实验组可以激活ERK1/2磷酸化并高表达BMP-2、ALP。而加入ERK1/2抑制剂PD98059可以降低脂多糖引起的ERK1/2磷酸化水平及BMP-2、ALP表达升高，提示ERK1/2在主动脉瓣钙化过程中起重要调控作用。

2.4 核因子κB(NF-κB)信号通路

Zeng等[25]在对人AVIC的研究中发现，脂多糖实验组与空白对照组相比，可以诱导BMP-2、ALP高表达；而NF-κB抑制剂SN50可以降低脂多糖引起的BMP-2、ALP的表达，提示NF-κB在主动脉瓣钙化过程中起重要调控作用。Patel等[30]用14%循环拉伸力模拟BAV环境，体外培养AVIC，转染miR-148a-3p组白细胞介素和MMP的表达水平较对照组降低，NF-κB抑制蛋白(IκB)表达增加，提示miR-148a-3p可以抑制NF-κB信号通路，引起白细胞介素和MMP表达降低，推断NF-κB信号对BAVC有促进作用。

2.5 Wnt信号通路

Wnt信号通路普遍存在，功能广泛，而其中最为经典的为Wnt/β-catenin信号通路。Carrion等[31]用Wnt激动剂体外培养AVIC 48 h，发现实验组ALP和BMP-2的mRNA水平较对照组明显升高；同时，拉伸应力组β-catenin mRNA表达水平及其靶基因CCND1表达水平较对照组分别增加39%、91%，且拉伸应力可以激活AVIC中的Wnt/β-catenin信号通路，提高钙化相关基因的表达。这进一步证实Wnt/β-catenin信号可能通过调控ALP和BMP-2水平促进BAVC发展。

3 信号通路的相互关系

过去研究认为各个信号通路是独立发挥作用的，但现在越来越多的学者认为各信号通路存在相互影响、彼此交叉的关系(见图3)。Notch通路、TGF-β通路、NF-κB通路、Wnt通路均可通过上调BMP-2水平促进pSmad1/5/8表达，进而正向调控成骨相关因子ALP、OPN、RunX2的表达，导致成骨分化及瓣膜钙化。同时，Notch通路对NF-κB通路亦有调控作用，并可直接激活ERK1/2磷酸化，从而调控下游成骨因子的表达。

图3 信号通路关系图

4 总结及展望

BAVC的发生和发展是多因素、多通路综合作用及交叉影响的结果。目前对其完整的发病机制尚无明确统一的论述。通过对BAVC相关蛋白进行研究，有望进一步了解BAVC病因，利用BAVC相关蛋白检测筛选高危人群，针对蛋白靶点进行干预治疗，延缓BAVC进程。