青蒿素对阿尔茨海默病模型细胞的影响及机制

龙惠萍，石胜良，王成志

(1 广西医科大学, 南宁 530031; 2 广西医科大学第二附属医院; 3 广西医科大学第三附属医院)

阿尔茨海默病(AD)是一种渐进性神经退行性疾病，其病理特征主要是老年斑、神经原纤维缠结及神经元缺失[1]。细胞自噬、氧化应激、炎症及细胞凋亡等多种因素共同参与了AD的形成[2]。β淀粉样蛋白(Aβ)过度沉积诱导的氧化应激是AD形成的主要原因之一[3]。此外，氧化应激反应又可促进Aβ的合成[4]。研究表明，清除活性氧(ROS)对于缓解AD的发生发展具有确切的疗效[5]。因此，减少Aβ诱导的氧化应激是AD潜在的一种治疗策略。目前针对AD的药物大多数为缓解性药物，尚无确切的能逆转AD的药物。青蒿素(ART)是一种倍半萜内酯分子，近年研究发现其除具有抗疟疾效用外，ART及其衍生物还具有神经保护作用[6]。目前，关于ART对AD发病机制中Aβ诱导氧化应激的影响尚不明确，相关研究较少。2018年1月～2019年1月，我们观察了ART对AD模型细胞活力、氧化应激、炎症因子及自噬的影响，为ART在AD防治中的应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂 BV-2小胶质细胞株由首都医科大学宣武医院馈赠。胎牛血清、DMEM培养基购自 Gibco 公司；青-链霉素双抗购自碧云天公司；ART、 β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)购自Sigma公司；CCK8购自同仁公司；RNA提取试剂盒购自OMEGA；cDNA 逆转录试剂盒和 PCR 试剂盒购自 TAKARA 公司；Cyto-ID细胞自噬检测试剂盒、Hoechst 33342购自ENZO Life Science；MitoSox Red线粒体超氧化物检测试剂盒购自Eugene公司；IL-1β、TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒购自武汉华美公司。Aβ1-42用二甲基亚枫(DMSO)溶解，用高压灭菌的双蒸水稀释至100 μmol/L。

1.2 细胞培养 BV-2 细胞在含有10%胎牛血清，1%青-链霉素双抗的 DMEM 高糖培养基中培养，置入37 ℃、5% CO2恒温细胞孵育箱中。每2天更换培养基1次，当细胞密度达到80%左右进行传代。取处于对数生长期的细胞用于实验。

1.3 ART有效浓度的确定 BV-2细胞(3×103/每孔)接种于96孔板，培养24 h后，加入不同浓度的ART(1、2、4、8、16、32、64 μmol/L)继续孵育24 h，采用CCK8法检测ART对BV-2细胞的毒性，确定后续实验所用浓度。通过CCK8法检测得到ART剂量范围为0～8 μmol/L时，对细胞无显著的毒性反应，因此选择8 μmol/L作为ART的有效浓度用于后续实验。

1.4 细胞分组及干预方法 将细胞分为正常对照组、Aβ1-42 组、ART组。正常对照组不做处理，Aβ1-42 组加入5 μmol/L的Aβ1-42制备AD细胞模型，ART组入8 μmol/L的ART及5 μmol/L的Aβ1-42，均干预24 h。

1.5 细胞活力检测 采用 CCK-8 法。各组细胞培养24 h 后，每个副孔加入10 μL的CCK8试剂并继续培养2 h，每组设6个副孔，用酶标仪测定每孔于450 nm下的吸光度(OD)值。

1.6 氧化应激水平检测 采用MitoSox Red染色法。各组细胞培养24 h时，去掉培养基，根据说明书加入MitoSox Red和Hoechst 33342的混合液，在37 ℃下避光孵育细胞30 min，PBS洗3次后，使用荧光显微镜观察MitoSox荧光强度并拍照。

1.7 炎症因子水平检测 ①采用Real-time PCR检测各组细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平。各组细胞培养24 h后，参照RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，并测定浓度，将RNA逆转录为cDNA，加入上游及下游引物进行PCR反应(引物序列见表1)。采用 2-ΔΔct法对数据进行相对定量分析。②采用ELISA法检测各组细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平。根据试剂盒说明，先加入50 μL标准品及50 μL待测样品，然后加入50 μL生物素标记的抗体。用封板膜封板后于37 ℃温育1 h。再加入亲和链酶素-HRP，37 ℃温育30 min，每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光显色10 min，迅速加入50 μL终止液，在450 nm波长处测定各孔的OD值。

表1 引物基本信息

1.8 自噬相关蛋白表达检测 ①采用 CYTO-ID染色法检测自噬体的变化。将细胞接种于放置灭菌处理过的细胞爬片的12孔板中，培养24 h使细胞贴壁生长在爬片上。处理细胞24 h后小心吸掉上清，用PBS洗2次，按 CYTO-ID Autophagy Detection Kit试剂盒说明书加入试剂染色剂CYTO-ID Green和细胞核染色剂Hoechst 33342，于37 ℃避光孵育30 min，再用PBS洗掉多余的染料，置于荧光显微镜下观察 CYTO-ID绿色荧光强度。②采用Real-time PCR法检测细胞自噬相关蛋白1(Beacline1)及微管相关蛋白轻链3(LC3) mRNA水平。各组细胞培养24 h后，参照RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，并测定浓度，将RNA逆转录为cDNA，加入上游及下游引物进行PCR反应(引物序列见表1)。采用 2-ΔΔCt法对数据进行相对定量分析。

2 结果

2.1 各组细胞活力比较 正常对照组、Aβ1-42 组、ART组细胞活力分别为(100.00±5.12)%、(62.50±7.54)%、(88.56±4.57)%。Aβ1-42 组细胞活力低于正常对照组，ART组细胞活力高于Aβ1-42 组(P均<0.05)。

2.2 各组氧化应激水平比较 正常对照组、Aβ1-42 组、ART组MitoSOX 荧光强度分别为(100.00±1.42)%、(208.46±4.11)%、(163.55±6.01)%。Aβ1-42 组荧光强度高于正常对照组，ART组荧光强度低于Aβ1-42 组(P均<0.05)。

2.3 各组细胞及上清液中炎症因子水平比较 Aβ1-42 组细胞及上清液TNF-α、IL-1β及IL-6 水平均高于正常对照组，ART组细胞及上清液TNF-α 、IL-1β及IL-6 水平均低于Aβ1-42 组(P均<0.05)。见表2。

表2 各组细胞及上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与Aβ1-42 组比较，﹟P<0.05。

2.4 各组自噬相关蛋白表达比较 正常对照组、Aβ1-42 组、ART组细胞CYTO-ID绿色荧光强度相对水平分别为100.00%±0.43%、72.0%±5.22%、150.0%±4.90%，Aβ1-42 组的荧光强度低于正常对照组，ART组荧光强度高于Aβ1-42 组(P均<0.05)。Real-time PCR结果显示，Aβ1-42组Beacline1、LC3 mRNA表达均低于正常对照组，ART组Beacline1、LC3 mRNA表达均高于Aβ1-42 组(P均<0.05)。见表3。

表3 各组细胞Beacline1、LC3 mRNA表达比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与Aβ1-42 组比较，﹟P<0.05。

3 讨论

AD是一种慢性进行性神经系统退行性病变，主要表现为进行性认知功能障碍和行为异常。细胞外Aβ的异常聚集是AD 的主要病理特点，是老年斑的组成成分之一。此外，异常积累的 Aβ还可导致线粒体功能异常，如能量代谢紊乱、氧化应激等。在氧化应激中，ROS的过量产生通过多种途径损害各种生物分子的结构和功能，如蛋白质、脂质和DNA[7]。研究表明，在AD 的发生发展过程中 Aβ与氧化应激有密切的关系[8]，Aβ的沉积诱导氧化应激的产生，氧化应激反应也可促进 Aβ的合成，两者相互促进，导致神经细胞损害和功能失调的恶性循环[7]。随着对抗氧化应激机制的深入研究，抗氧化剂在AD临床前期治疗取得了一定的成功。目前常用的抗氧化剂包括硒、辅酶Q10、维生素C、维生素E。尽管目前基础研究取得了很大的进展，但AD的发病机制尚未得到明确的解释，缺乏有效的治疗方法。基于ART对神经细胞的保护作用，表明其可能对 AD 有潜在的治疗作用。本研究对ART对AD模型细胞活力、氧化应激、炎症因子及自噬的影响进行了实验验证。

ART是从黄花蒿茎叶中提取的有过氧基团的倍半萜内酯。其被广泛用于疟疾的治疗，此外还有抗寄生虫、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、保护血脑屏障和免疫调节的作用[6, 9]。近年研究发现，ART在 AD 细胞模型中可抑制 Aβ1-42的产生[9]。ART可通过抑制 NF-κB 活性和 NALP3炎性体活化，延缓 APPswe /PS1dE9 转基因小鼠的Aβ沉积进程[10]。研究还发现 ，ART 对神经细胞 PC12 具有营养和保护作用[11]，表明ART对 AD 有潜在的治疗作用。本研究发现，Aβ1-42组细胞活力低于正常对照组，而ART组的细胞活力高于Aβ1-42组，提示ART能改善Aβ1-42对BV-2细胞活性的抑制；Aβ1-42 组荧光强度高于正常对照组，ART组荧光强度低于Aβ1-42 组，表明ART能改善Aβ1-42诱导的BV-2细胞的氧化应激水平。

自噬是广泛存在于真核细胞中维持细胞内环境稳定的过程[12]。自噬途径可以降解功能受损的细胞器及异常聚集的蛋白质。炎症反应是一种保护性反应，过度的炎症反应则会导致组织损伤和疾病；而自噬可通过降解DNA、活性氧族等内源性刺激来抑制炎性小体聚集，降解IL-1β前体从而抑制IL-1β等促炎因子的分泌。研究表明，AD转基因小鼠脑内mTOR表达升高，细胞自噬启动受阻，Aβ沉积增多[13]，但给小鼠脑内注射mTOR的抑制剂，激活细胞自噬后，Aβ沉积减少，而且小鼠认知水平也提高。Beclin1的表达是自噬体启动的标志物，转基因AD小鼠脑内 Beclin1表达水平下降，Aβ沉积增加[14]。还有研究表明，Aβ1-42能抑制PC-12细胞的自噬水平[3]。本研究发现，Aβ1-42组的细胞及上清液中炎症因子水平均比正常对照组高，而ART组的炎症因子较Aβ1-42组的低，表明ART抑制了Aβ1-42所致的BV-2细胞炎症因子水平增加；Aβ1-42组CYTD-ID 绿色荧光强度较正常对照组减弱，且Beacline1、LC3 mRNA表达水平低于正常对照组，但ART组的荧光强度及Beacline1、LC3 mRNA表达水平高于正常对照组及Aβ1-42组，表明ART激活了细胞的自噬水平。

综上所述，ART能提高AD模型细胞的活性，抑制细胞氧化应激及炎症因子分泌，其机制可能与ART增加自噬激活有关，这为ART应用于AD早期炎症及氧化应激反应的防治提供了一定实验基础和理论依据。但本实验仅为体外实验结果，且只选取了单一浓度，后续有待进一步选取多个浓度在体内外实验中进行验证。