胃癌化疗抵抗基因PMP22下游的生物信息学机制

汪圣毅，张永红，闫亚飞，李旭升，程 彦，李永翔

化疗(chemotherapy，CTx)可控制非治愈因素，改善无法手术切除胃癌患者的预后[1]，可降低循环肿瘤细胞数，降低淋巴结、局部和腹膜的复发，附加药物可逆转免疫细胞的功能，抑制胃癌细胞的增殖迁移[2]。但CTx亦使癌细胞发生适应性改变，产生耐受或抵抗，与癌细胞基因表达和相关通路的变化有关。外周髓磷脂蛋白22(peripheral myelin protein 22，PMP22)与CTx抵抗、肿瘤发生有关[3]，PMP22表达干预可致下游基因表达变化[4]，其上调与胃癌细胞抵抗顺铂的作用有关[5]，但其下游机制尚不明确。生物信息学方法可揭示疾病基因模块和网络，应用广泛[6]。该研究采用生物信息学方法，比较短发夹核糖核酸敲减和未敲减PMP22的下游差异表达基因(defferentially expressed genes, DEGs)，分析其相关通路，为胃癌CTx抵抗的分子机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂、平台基因表达数据库(gene expression omnibus，GEO)GSE(基因表达数据库系列，GEO series)94714胃癌细胞系MGC-803、慢病毒载体(plasmid lentiviral vector，pLKO.1)购自中科院细胞所。PMP22的短发夹核糖核酸(short hairpin RNA，shRNA)共2个，shRNA1： CCAAACTCAAACC AAACCAAA，shRNA2：CGGTGTCATCTATGTGATCT T，Lipofectamine 3000(美国Invitrogen公司)将含有shRNA1、shRNA2的慢病毒转染至293T细胞扩增，转染筛选MGC-803，美国安捷伦公司芯片平台测试基因表达谱[5]。

1.2 表达谱数据PMP22敲减和未敲减组的差异基因表达谱，取自美国国立生物技术信息中心(national center for biotechnology information，NCBI)的GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)，由Cai et al[5]提交，样本为：1：数据库样本(GEO sample, GSM)GSM2481329；2：GSM2481330；3：GSM2481331；4：GSM2481332；5：GSM2481333；6：GSM2481334，1～3为A组，PMP22_shRNA2敲减PMP22基因的表达，4～6为B组，未抑制PMP22基因的表达。

1.3 差异基因数据库R语言(GEO to R, GEO2R)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/?acc=GSE94714)定义A、B组别，美国国家标准学会(American national standards institute，ANSI)格式保存所有差异基因至.txt文件，导入Excel 2016筛选，筛选条件：① 校正P<0.01；② 倍数变化(fold change，FC)值≥10或≤-10，计算logFC：log2(A/B)=log2(A)-log2(B)，分别为±3.321 928。

1.4 富集和通路分析差异基因于注释、可视化和综合发现数据库(database for annotation, visualization and integrated discovery,DAVID)网站(https://david.ncifcrf.gov/)，分析基因本体(gene ontology，GO)的生物过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、细胞组分(cellular component，CC)，分析京都基因和基因组百科全书(kyotoencyclopedia of genes and genomes，KEGG)的通路。选BP、MF、CC中P值最小的前6位，绘制复合条图。KEGG结果绘制泡泡图。

1.5 蛋白质相互作用DAVID转换基因名为官方基因标识，文本正则表达式截取基因名称，导入互作基因检索工具(search tool for the retrieval of interacting genes，STRING)数据库(http://string-db.org/)，Homo Sapiens获蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)的网络。数据导入Cytoscape 3.6.1，分子复合检测(molecular complex detection，MCODE)插件行模块分析，单一模块中的基因导入DAVID 6.8行通路分析。

1.6 关键基因筛选PPI数据导入Cytoscape 3.6.1，CytoHubba插件筛选关键基因，用最大集团中心性(maximal clique centrality，MCC)的拓扑算法。

1.7 癌症药物敏感性基因组学数据库验证logFC绝对值由高到低排序，前10位的基因和MCC算法获得的关键基因，导入癌症药物敏感性基因组学(genomics of drug sensitivity in cancer，GDSC)数据库，分析与胃癌CTx敏感性的关联性。

1.8 统计学处理差异表达基因(DEGs)为GEO中R语言limma包完成分析，数据矩阵线性拟合，本雅米尼·霍赫贝格错误发现率(false discovery rate，FDR)校正。

2 结果

2.1 样本数据特征数据归一化的中位数均为5.4，均数为6.21，中位数位于同一水平，标准化特征良好，见图1。

图1 样本基因表达数据的归一化结果

1：GSM2481329；2：GSM2481330；3：GSM2481331；4：GSM2481332；5：GSM2481333；6：GSM2481334

2.2 差异基因GEO2R结果获34 183个与GEO ID对应的序列。AdjustedP<0.01，logFC=3.321 928，筛选到368个对应的ID，删除无基因库登录号(gene bank accession number，GB_ACC)的30行。GB_ACC转换基因名，获315个DAVID IDs，Excel查重删除1个重复，vlookup函数将基因名对应至差异筛选表，找回logFC值，countif函数计算获上调基因283个，下调31个。logFC绝对值最大的前10位见表1。

表1 logFC绝对值前10位的差异表达基因

EEF1A1：真核翻译延长因子1α1；HSP：热休克蛋白；ITGB1：整合素亚单位β1；SLC3A2：印记基因家族3成员2；KDM1A：赖氨酸脱乙基酶1A

2.3 GO和KEGG分析富集到BP、MF、CC的基因分别有271、277、283个，为注释基因的86.3%、88.2%、90.1%，140个基因(44.6%)参与KEGG通路。BP、MF、CC中P值最小的前6位，换算成-log10(P值)为纵坐标，横坐标各分类的基因计数为右侧y轴绘图，见图2。CC中富集在核、膜、核质、细胞外外泌体、细胞黏着连接、蛋白复合体等的基因差异显著，见图2A；BP中参与细胞-细胞黏附过程的基因P值最低，参与基因数为19，见图2B；MF中P值最低的为多聚腺嘌呤核糖核苷酸结合，参与基因数目最多的为蛋白质结合，见图2C。富集前5位的通路为细胞周期、氨基酸的生物合成、无翅型整合位点家族(wingless-type integration site family， Wnt)、转化生长因子β、半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路，见图2D。

2.4 蛋白质相互作用PPI数据导入Cytoscape，MCODE聚类，节点连接度(degree)值=2，节点(node)评分值=0.2，k-分(core)=2，最大深度(max.depth)=100，获11个模块，评分前4的模块4个，评分分别为9、7、5、4.909，Node数目分别为9、7、7、12，边(Edge)数目分别为36、21、15、27，见图3。单个模块中的基因行通路分析，主要与剪接体、泛素介导的蛋白水解共2个KEGG(P<0.01)和3个反应组(REACTOME)(P<0.05)通路关联，见表2。

表2 PPI网络模块中的基因富集通路

R-HSA：反应组人类通路标识码

2.5 PPI中的关键基因MCC算法计算前10个关键基因为：肽基脯氨酰异构酶E(peptidylprolyl isomerase E，PPIE)、不均一核核糖核蛋白A1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1，HNRNPA1)、Y盒结合蛋白1(Y-box binding protein 1，YBX1)、不均一核核糖核蛋白K(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K，HNRNPK)、不均一核核糖核蛋白A2B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1，HNRNPA2B1)、死亡盒解旋酶9(DExH-Box helicase 9，DHX9)、U6小核糖核酸相关Sm样蛋白(U6 snRNA-associated sm-like protein，LSM4)、小核核糖核蛋白多肽N(small nuclear ribonucleoprotein polypeptide N，SNRPN)、多聚谷氨酰胺结合蛋白1(polyglutamine binding protein 1，PQBP1)、热休克蛋白90α家族A类成员1(heat shock protein 90 alpha family class a member 1，HSP90AA1)，评分分别为41 970、40 395、40 372、40 352、40 346、40 341、40 324、40 324、40 321、2 336，颜色排序见图4。

图2 基因本体(GO)分析

图3 PPI网络的聚类模块

A：评分第1的9节点网络结构；B：评分第2的7节点网络结构；C：评分第3的7节点网络结构；D：评分第4的12节点网络结构

图4 MCC算法的关键基因及其相互作用关系

2.6 差异和关键基因与药物敏感性的关系GDSC分析显示，富含腺嘌呤胸腺嘧啶蛋白质1A交互域(AT-rich interactive domain-containing protein 1A，ARID1A)基因突变与胃腺癌对CTx药物的敏感性有关，顺铂作用ARID1A突变的胃癌细胞，半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)值升高(P=0.050 016)；卵巢癌、结直肠腺癌ARID1A基因突变时，顺铂作用的IC50值降低，P值分别为0.005、0.047，见图5。DHX9基因突变与多种癌细胞的药物敏感性有关，但未见与胃腺癌药物敏感性的关联。其他top 10差异基因和MCC筛选的关键基因尚无GDSC数据库资料。

3 讨论

PMP22下游基因主要富集在细胞核、膜、核质、胞外外泌体、黏着连接、蛋白复合体等成分，参与细胞-细胞黏附过程、多聚腺嘌呤核糖核苷酸结合、蛋白质结合，参与细胞周期、氨基酸生物合成、Wnt和转化生长因子β、半胱氨酸蛋氨酸代谢等通路。PPI网络模块主要通过剪接体、泛素介导的蛋白水解、热休克因子1活化、轴突导向因子3A p21活化激酶依赖性轴突排斥、肌动蛋白动力调节形成吞噬杯、缝隙连接等通路发挥作用，与PPIE、ARID1A等有关。

PMP22敲减后ARID1A上调，顺铂敏感性增强，与ARID1A阳性表达胃癌患者无病生存率提高[7]的结果一致。GDSC分析见胃癌细胞顺铂敏感性与ARID1A突变的关联P值略大于0.05，可能与突变组的样本量少有关。DHX9突变与胃腺癌以外的其他多种癌细胞的顺铂敏感性有关。Top10差异基因、关键基因中的其他基因，GDSC未见记录，可能是PMP22下游尚未明确的新基因。

GO和KEGG分析显示，外泌体、细胞黏着粘附、蛋白质结合功能均与PMP22相关CTx敏感性有关。外泌体传递miR-155至敏感细胞介导乳腺癌的CTx抵抗[8]。外泌体合成分泌抑制使去势抵抗的前列腺癌细胞的CTx敏感性增强。细胞黏着连接因E-cadherin丢失而崩解，肿瘤细胞会避开失巢凋亡，CTx抵抗性增强[9]。细胞黏附生物过程的基因P值最小，表明与CTx抵抗显著关联。细胞间黏附分子-1中和抗体减少Jurkat细胞与间充质干细胞的黏附，减少细胞间线粒体转运，使Jurkat细胞的CTx敏感性增强[10]。分子功能中的蛋白质结合功能，通过结合互作调节CTx敏感性。分化抗原133与磷脂酰肌醇3激酶 (phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K)PI3K-p85的直接作用可活化PI3K/PKB(蛋白激酶B)通路，导致胃癌细胞的多种药物抵抗[11]。通路方面，胃癌细胞CTx抵抗与Wnt通路的关联性已有报告[12]，与本文的KEGG分析结果相似，其余未见文献报道的通路，如泛素化降解与胃癌CTx抵抗的关系，是未来研究的方向。

图5 ARID1A基因突变与顺铂敏感性的关系

PPI网络以系统视角揭示CTx抵抗的机制，本研究构建的PPI网络中提取4个亚模块，获10个关键基因，其中的DHX9、应激诱导磷蛋白1(STIP1)基因突变与CTx抵抗或敏感性关联，GDSC得到验证，尚无验证的可能是CTx抵抗相关新基因。PPI模块涉及的剪接体、泛素介导蛋白水解通路与骨肉瘤[13]、结直肠癌的发生发展相关联[14]，睡美人转座子突变研究[15]显示，泛素介导蛋白水解和细胞黏着连接也是胃癌中的失控通路。

本研究显示了PMP22下游参与CTx抵抗的网络成员，作为胃癌CTx抵抗的基因标志，为CTx抵抗精准治疗的靶点研究提供了参考。