LPS对丙型肝炎病毒复制以及Ⅰ型干扰素信号通路的影响

朱紫衣，王文博，刘 媛，江忠勇，常 凯，叶雨笙，熊 杰

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染是引起慢性肝病的重要病原体之一，并且HCV感染通常不会产生适当的固有免疫反应，导致80%的感染者转为慢性感染，其中一部分随之诱发为HCV感染相关性肝硬化及肝癌，严重威胁人类健康[1]。Toll样受体(toll-like receptors,TLRs)作为一种病原体识别受体，在固有免疫和适应免疫中发挥重要作用，其中最早被鉴定为TLRs的TLR4作为革兰阴性细菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)受体，具有抗细菌和抗病毒感染的作用[2]。既往研究[3-4]表明，LPS可以抑制巨噬细胞内登革热病毒以及HIV的复制，体内体外实验[5-7]也表明LPS可以抑制HBV的复制，然而关于LPS体外对于HCV复制的影响尚未见报道。该研究拟通过相关实验来研究LPS对HCV复制以及对Huh7Ⅰ型干扰素(interferon-Ⅰ,IFN-Ⅰ)信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料Huh7细胞及感染性HCV病毒颗粒(cell-culture-derived infectious HCV，HCVcc)由本实验室保存，Huh7培养于DMEM培养基，内含10%胎牛血清、100 mg/L链霉素和100 U/ml青霉素，置于 37 ℃、5% CO2、相对饱和湿度的细胞培养箱中进行培养，待细胞生长至融合，按1 ∶2或1 ∶3进行传代，取对数生长期细胞进行实验。

DMEM培养基、胎牛血清购自美国GIBCO公司；脂多糖购自美国Sigma公司；TRIzol试剂盒、CCK8细胞增殖和毒性检测试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；细胞周期及凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；实时定量PCR试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；HCV感染者血清收集自本科室检测标本。

1.2 实验方法

1.2.1LPS对Huh7生长增殖的影响 采用CCK8法。将Huh7按1×104个/孔接种96孔板，贴壁后分别加入浓度为100、10、1、0.1 mg/L的LPS，继续培养24、48 h后，每孔加入培养基总体积10%的CCK8溶液，在培养箱中继续培养2 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光值(OD)。

1.2.2LPS对HCV复制的影响 将Huh7按1×104个/孔接种96孔板，培养24 h后，以0.5感染复数(multiplicity of infection,MOI) HCVcc感染Huh7，并加入100 mg/L LPS，以未加LPS作为对照，培养24 h以及48 h后，用TRIzol试剂抽提细胞总RNA，进行PCR扩增。

1.2.3免疫荧光(IFA)检测LPS对HCVcc感染 Huh7的影响Huh7按1×104个/孔接种96孔板，24 h后加入0.5 MOI HCVcc，并加入LPS,48 h后弃上清液，PBS洗2遍，加入甲醇100 μl/孔，置于-20 ℃ 冰箱固定20 min，PBS洗1遍，加入3% BSA，室温封闭2 h；而后加入用100 μl HCV感染者血清(1 ∶100)，室温孵育2 h后，PBS洗涤3次，加入Alex-488羊抗人IgG(1 ∶100)，避光孵育40 min后，用PBS洗涤2遍，荧光显微镜观察并拍照。

1.2.4LPS对Huh7细胞凋亡及细胞周期的影响 将对数生长期的Huh7按1×105个/ml接种6孔板，贴壁后加入100 mg/L LPS,48 h后消化、离心收集细胞，加入5 μl Annexin V-FITC后，再加入5 μl碘化丙啶(propidium iodide,PI)混匀，室温、避光反应15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

Huh7按1×105个/ml接种6孔板，贴壁后更换不含血清的培养基，使其同步，8 h后加入100 mg/L的LPS，孵育48 h后消化、离心收集细胞，70%冰乙醇固定24 h后，PBS洗涤、离心，加入PI染色工作液，避光染色30 min，流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.5Real-time PCR 按照TRIzol试剂盒说明书操作，提取待测细胞总RNA，并以之为模板采用SYBRGreen法进行qPCR扩增反应，以GAPDH作为内参基因，反应条件为：45 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，59 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s,循环进行40次，采用2-ΔΔCt法分析各处理组HCV RNA水平。所用引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，具体引物序列如下：HCV上游引物：5′-CTTCACGCAGAAAGCGTCTA-3′，下游引物：5′-CAAGCACCCTATCAGGCAGT-3′；GAPDH上游引物:5′-TGGGCTACACTGAGCACCAG-3′，下游引物:5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAAT-3′。

1.2.6Western blot检测IFN-α、IFN-β蛋白水平 将Huh7调整细胞浓度为1×105个/ml接种到24孔板中，置于培养箱中培养。贴壁长至70%时，分别加入100 mg/L LPS以及0.5 MOI HCVcc，分别孵育2、4 h后预冷PBS洗涤2次，裂解、提取蛋白进行蛋白定量检测。SDS-PAGE电泳后转膜、封闭，再分别孵育鼠抗IFN-α抗体(1 ∶500)、兔抗IFN-β抗体(1 ∶500)、鼠抗GAPDH 抗体(1 ∶1 000)，4 ℃过夜；TBST洗膜3次，每次10 min，加二抗(1 ∶1 000)，室温孵育2 h；TBST洗膜3次，使用BCIP/NBT碱性磷酸脂酶显色试剂盒进行显色。Image J软件对结果进行灰度分析。

2 结果

2.1 LPS对Huh7的细胞增殖的影响Huh7接种96孔板，加入不同浓度的LPS，24 h及48 h后行CCK8试验，检测细胞增殖活性。本研究实验均独立重复进行3次，结果见图1、表1。与对照组比较，10 mg/L LPS对Huh7有促进细胞增殖的作用(P<0.05)，余各浓度LPS对Huh7生长增殖无明显影响(P>0.05)，因此余后续实验采用100 mg/L处理。

图1 不同浓度的LPS对Huh7细胞增殖的影响

2.2 LPS在细胞水平上抑制对HCV的感染及复制结果显示用100 mg/L LPS处理细胞后，HCV mRNA显著降低，24 h对照组和实验组(LPS 100 mg/L)HCV相对mRNA水平分别为(0.902±0.169)、(0.269±0.138)，差异有统计学意义(t=5.016，P=0.007)；48 h对照组和实验组HCV相对mRNA水平分别为(0.930±0.121)、(0.647±0.065)，差异有统计学意义(t=3.567，P=0.023)，见图2。

图2 LPS对HCV复制的影响

表1 各浓度LPS处理组的OD450 nm值

为进一步明确LPS对HCV感染的抑制作用，以HCV感染者血清为一抗，通过免疫荧光法检测LPS处理Huh7后细胞内抗核心蛋白抗体的表达。结果如图3所示，100 mg/L的LPS处理组HCV结构蛋白水平明显减低。

2.3 LPS对Huh7细胞周期和凋亡的影响通过流式细胞仪检测细胞周期及凋亡，结果如图4所示：以100 mg/L LPS作用于Huh7 48 h后，与对照组比较，实验组细胞凋亡率减低，分别为(2.130±0.001)% 、(1.070±0.002)%，差异有统计学意义(t=11.314，P=0.001)。LPS作用Huh7 48 h后，细胞周期发生明显改变，实验组进入分裂期(G2+M期)的细胞比例明显低于对照组，而S期细胞明显增多(图5、表2)。

表2 LPS对Huh7细胞周期的影响

与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01

2.4 LPS对Huh7细胞IFN-α、IFN-β表达的影响结果如图6所示，LPS刺激细胞后，IFN-α、IFN-β均表达上调(P<0.05)。HCV感染引起IFN-α、IFN-β表达增加，尤其是IFN-β；此外，LPS抑制了HCV引起的IFN-β的表达上调，但对IFN-α表达无明显影响。

图3 以HCV感染者血清为一抗检测Huh7细胞中的HCV蛋白表达×100

A：对照组；B：0.1 mg/L LPS；C：1 mg/L LPS ；D：10 mg/L LPS；E：100 mg/L LPS

3 讨论

据世界卫生组织统计，全球约有1.85亿人感染HCV ，HCV感染已成为全球关注的重要公共健康问题[8-9]。近年来，直接抗病毒药物(DAA)药物的上市为HCV的患者带来了福音[10]，但DAA药物价格昂贵，且安全性和有效性有待于长期追踪。TLR在防御病原体感染发挥重要作用，病毒感染能够刺激TLR信号，使机体发挥免疫清除的作用。然而，HCV感染激活TLR信号的同时，也通过不同机制损害TLR信号，从而逃避免疫清除，所以理论上来说通过使用TLR激动剂恢复TLR信号是一种潜在的治疗方法[11]。本研究显示TLR4的配体LPS可以在细胞水平抑制HCV的复制及感染。细胞凋亡与周期实验结果显示LPS处理后能够使Huh7细胞凋亡减低，S期细胞明显增多，这与既往研究[12]结果相符。细胞毒性实验也说明100 mg/L LPS对Huh7细胞生长增殖无明显作用，说明LPS抑制HCV的复制与感染并非通过细胞毒性作用来实现的。

图4 LPS对Huh7细胞凋亡的影响

图5 LPS对Huh7细胞周期的影响

图6 Western blot法检测IFN-α、IFN-β蛋白的表达情况

A:IFN-α;B:IFN-β;与未处理组比较：*P<0.05；与HCV组比较：#P<0.05

IFN-Ⅰ能够抵抗多种病原体的感染，且HCV刺激机体免疫系统所产生抗病毒和免疫调节物质主要是IFN-Ⅰ[13]，本研究检测LPS对Huh7细胞IFN-Ⅰ信号通路影响，以期为LPS抑制HCV的复制提供些许理论依据。实验结果显示LPS刺激细胞后，IFN-α、IFN-β均表达上调，而IFN-α、IFN-β参与抑制HCV的复制是非常明确的[14]。Barjesteh et al[15]认为TLR配体处理鸡巨噬细胞后可抑制禽流感病毒的复制，可能与其配体诱导IFN-α、IFN-β等抑制病毒复制的基因表达增加有关，但未对TLR配体对流感病毒感染引起的相关抗病毒基因的表达影响进行研究。本研究显示HCV感染可以迅速激活IFN-Ⅰ信号通路，使IFN-α、IFN-β表达上调，同时LPS抑制了HCV感染引起的IFN-β表达上调，而对IFN-α表达无明显影响。这说明LPS可能通过干扰HCV感染细胞引起天然免疫应答，从而影响HCV的感染与复制，但LPS具体通过何种机制影响病毒感染引起干扰素信号通路表达变化，尚未见明确报道，有待于进一步研究。