环氧合酶-2 对酸和胆盐诱导的人鳞状细胞凋亡的影响及机制

申建刚 王红芳 陈丽 李俊达 李勇年

深圳市龙华区人民医院消化内科（广东深圳518109）

Barrett 食管（Barrett′s esophagus，BE）是指正常的复层鳞状上皮被单层柱状上皮所取代的一种病理现象，其发生主要与胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease，GERD）、遗传、肥胖、生活方式、性别、种族等相关，其中GERD 最重要［1］。BE 伴肠上皮化生者属于食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）的癌前病变［2］。阻止BE 发生、发展是避免EAC 的一个重要途径。目前BE 发病机制尚不清楚。研究［3-4］发现，在人BE 组织中环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）表达较周围鳞状上皮组织显著增高，所以推测COX-2 在BE 发病中起重要作用。

本研究通过体外培养人食管鳞状细胞，利用基因转染技术，在细胞内沉默COX-2 表达，探讨COX-2 对酸和胆盐诱导的人鳞状细胞凋亡的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 试剂 COX-2、尾型同源盒转录因子-2（caudal-related homeoboxgene-2，CDX-2）、磷酸化核转录因子-κB（phosphorylation of nuclear factor-κB，NF-κB/p-P65）及GAPDH 鼠抗人单克隆抗体、荧光标记的羊抗鼠二抗均购自美国Epitomics 公司；MTT、二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma 公司；RNA 提取Trizol试剂盒、脂质体Lipofectamine2000、RPMI1640、胎牛血清购自美国Invitrogen 公司。将胆盐成分［5］（sigma 公司）牛磺胆酸、甘氨胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、牛磺鹅脱、氧胆酸、甘氨脱氧胆酸和牛磺脱氧胆酸按20∶15∶3∶6∶1 的比例混合加入培养基。

1.2 细胞培养 人食管鳞状细胞株HET-1A 购自美国标准菌库（ATCC，Manassas，VA，USA）。细胞用含有10%胎牛血清和RPMI 1640 培养基，于37 ℃、5%CO2环境中培养。

1.3 siRNA 的构建及转染 抗人COX-2 siRNA 购自上海吉玛制药技术有限公司，COX-2 siRNA 序列正义：5′-AACUGCUCAACACCGGAAUtt-3′；反义：5′-AUUCCGGUGUUGAGGAGUUtt-3′。阴性对照siRNA 序列正义：5′-UUCUCCGAACGUGUCACG Utt-3′；反义：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAAtt-3′。待Het-1A 细胞生长到占培养瓶底90%时消化，离心，重悬后转入24孔板中。当细胞生长到约60%～70%的融合面积时进行转染。实验分为4 组：空白对照组（只接种HET-1A 细胞未作任何处理）、阴性对照组（用阴性siRNA 转染HET-1A 细胞）、COX-2 组（用COX-2 转染HET-1A 细胞）及COX-2 siRNA 组（用COX-2 siRNA 转染HET-1A 细胞）。通过Western blot检测COX-2表达判断转染效果。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡 收集细胞，加入100 μL buffer，混匀，用10 μL FIYC 和5 μL PI 进行染色，4 ℃避光作用30 min 后，再加入300 μL buffer，混匀，将细胞置激发光为488 nm 波长的FACS Calibur 型流式细胞仪检测。用ModFit LT 软件分析结果。

1.5 Western blot 检测蛋白表达 将待测细胞接种于6 孔板中，培养48 h 后收集细胞并用冰PBS 液洗涤3 次。用含1% Triton X-100 的细胞裂解液裂解细胞。收取总蛋白，按常规方法进行SDS-PAGE凝胶电泳、转膜。一抗为鼠抗人COX-2、CDX-2、p-P65 单克隆抗体及鼠抗人GAPDH 单克隆抗体，二抗为荧光标记的羊抗鼠抗体，进行抗原抗体反应，然后进行荧光显色并测定反应条带灰度值，以GAPDH 作为内参，计算相对值，重复3 次。

1.6 统计学方法 采用SPSS 19.0 统计软件进行统计分析，数据用均数±标准差表示，所用方法为析因方差分析、单因素方差分析，组间多重比较用LSD 法。

2 结果

2.1 siRNA 转染效果 利用基因转染技术，使COX-2 在HET-1A 细胞内过表达及基因沉默，48 h后收集细胞，用Western blot 检测COX-2 表达，可见COX-2 转染成功（图1）。

图1 COX-2 在HET-1A 细胞内过表达及基因沉默后的表达Fig1 Expression of COX-2 in HET-1A cells after overexpression and gene silencing

2.2 酸、胆盐和二者混合物诱导HET-1A 细胞凋亡 根据预实验结果，盐酸调整培养基PH 值，最终选取pH 值为6.0，作用时间30 min 干预细胞；胆盐浓度选取1 200 μmol/L，作用时间30 min。根据酸和胆盐浓度不同，实验分4组：（0 μmol/L，pH 7）、（1 200 μmol/L，pH 7）、（0 μmol/L，pH 6）、（1 200 μmol/L，pH 6），流式检测细胞凋亡（图2）。结果显示，以上4 组凋亡率分别为（2.52±0.45）%、（7.23±0.62）%、（4.49 ± 0.45）%和（28.37 ± 1.57）%，酸、胆盐及二者混合物均诱导细胞凋亡，酸的作用最弱，混合物作用最强［（4.49 ± 0.45）%vs.（28.37 ± 1.57）%，P＜0.05）］。

图2 流式细胞术检测酸、胆盐及二者混合物诱导的HET-1A 细胞凋亡Fig2 Apoptosis of HET-1A cells was induced by acid，bile salts and their mixture

2.3 在HET-1A 细胞内酸、胆盐和二者混合物增加了COX-2、p-P65和CDX-2的表达 根据前期结果设置分组为：（0 μmol/L，pH 7）、（1 200 μmol/L，pH 7）、（0 μmol/L，pH 6）、（1 200 μmol/L，pH 6），干预HET-1A 细胞30 min，Western blot 检测COX-2、p-p65及CDX-2的表达水平，见图3，处理组COX-2、p-P65 及CDX2 的表达相比正常组均上调，胆盐和盐酸混合处理组上调最明显。

2.4 基因沉默COX-2 对酸和胆盐混合物诱导的HET-1A 细胞凋亡的影响 根据前期结果设置实验分3 组：（0 μmol/L，pH 7）、（1 200 μmol/L，pH 6）和siCOX-2（1 200 μmol/L，pH 6）。HET-1A 细胞转染COX-2 siRNA，48 h 收样检测前取盐酸pH 6.0 联合1 200 μmol/L 的胆盐处理30 min，流式细胞术检测细胞凋亡（图4），结果显示细胞凋亡率分别为（3.69±0.44）%、（45.27±2.62）%和（53.67±1.26）%，基因沉默COX-2 后细胞凋亡增加（P＜0.05）。

图3 在HET-1A 细胞内酸、胆盐和二者混合物增加了COX-2、p-P65 和CDX-2 的表达Fig.3 The expressions of COX-2，p-P65 and CDX-2 were increased in the presence of acid，bile salts and mixtures in HET-1A cells

图4 基因沉默COX-2 增加酸和胆盐混合物诱导的HET-1A 细胞凋亡Fig.4 Gene silencing COX-2 increased apoptosis of HET-1A cells after acid and bile salts mixtures induction

2.5 基因沉默COX-2 后酸和胆盐混合物诱导的HET-1A 细胞内COX-2、p-P65 和CDX-2 表达均减弱 细胞转染COX-2 siRNA，48 h 收样检测前取盐酸pH 6.0联合1 200 μmol/L的胆盐处理，HET-1A处理30 min，Western blot 检测COX-2、p-P65 及CDX-2的表达水平，结果显示（图5），酸和胆盐混合物处理细胞后COX-2、p-P65 和CDX-2 蛋白表达均上调，干扰COX-2 后以上蛋白表达均下降。

3 讨论

目前研究认为BE 多由严重而长期的胃和十二指肠内容物反流刺激食管下段所致，主要是酸和胆汁反流［6-7］。BE 来源于食管鳞状细胞还是来源于干细胞有待研究，但多数认为BE 可能由食管鳞状细胞分化而来，BE 具体发生机制尚不明确［8-10］。研究发现［11-12］，COX-2 在人BE 组织中表达明显高于周围鳞状细胞及对照组组织，炎症刺激后COX-2 在食管鳞状细胞内表达增强，提示COX-2 可能在BE 发生、发展中起重要作用。

图5 基因沉默COX-2 后酸和胆盐混合物诱导的HET-1A细胞内COX-2、p-P65 和CDX-2 表达均减弱Fig.5 Gene silencing COX-2 decreased the expression of COX-2、p-P65 and CDX-2 in the presence of acid and bile salts mixtures in HET-1A cells

本研究模拟人体酸和胆盐环境，在酸、胆盐及二者混合物作用下培养食管鳞状细胞，探讨COX-2对食管鳞状细胞凋亡的影响。研究发现酸、胆盐及二者混合物均可诱导HET-1A 细胞发生凋亡，其中酸、胆盐二者混合物的作用最强，其作用是单独酸或胆盐的数倍，可能二者联合可以发挥协同作用。酸和胆盐诱导细胞凋亡的同时伴随COX-2 表达增强，基因沉默COX-2 后细胞凋亡增加，提示COX-2 参与调控了酸、胆盐诱导的食管鳞状细胞凋亡，COX-2 可能参与了BE 的发生、发展过程。

NF-κB［13-14］作为炎症反应的重要表达因子，被认为在炎症发展到癌症过程中起重要作用，NF-κB 在多种细胞、组织中参与细胞凋亡过程；研究发现［15］NF-κB 在BE 异型性、食管腺癌组织中表达增高，可能是通过激活生存素作为抗凋亡因子发挥作用。BUS 等［16］证实在食管鳞状细胞中抑制NF-κB可以抑制细胞增殖，伴随COX-2 表达降低。PARK等［17］发现在平滑肌瘤细胞中COX-2 抑制剂塞来昔布可以通过NF-κB 通路抑制细胞增殖。以上提示NF-κB 在BE 发生中起重要作用，NF-κB 与COX-2可互相调节。本研究发现COX-2可诱导HET-1A细胞凋亡，可能是通过NF-κB信号通路实现的。

CDX做为尾型同源核转录因子家族成员之一，是肠道发育过程中特异性表达的核转录因子，调节肠上皮细胞的增殖和分化［18］。CDX-2 在BE 肠化生中起关键作用，其在食管中的表达是肠化生的早期特异性标志［19］。本研究证实在HET-1A 细胞内COX-2 可以调节CDX-2 表达，提示COX-2 可能在食管鳞状细胞肠化过程中起重要的作用。

综上所述，基因沉默COX-2 表达可以促进酸、胆盐诱导的食管鳞状细胞凋亡，其机制可能是COX-2 通过调节p-P65 及CDX-2 表达实现的。提示COX-2 可能参与了BE 的发生、发展过程，需要进一步研究COX-2 在BE 发生、发展中的作用及机制。