程序性细胞死亡因子-1 在大鼠肺缺血再灌注损伤中的作用

何义 林飞 潘灵辉 杜学柯 葛万运 王甜甜 肖靖远

广西医科大学附属肿瘤医院麻醉科（南宁530021）

肺缺血再灌注损伤（lung ischemia-reperfusion injury，LIRI）是肺组织经过一段时间的缺血后，再恢复血流供应时触发一系列复杂级联反应导致肺损伤进一步加重的病理过程。临床上常发生于肺移植、体外循环、肺的袖式切除、创伤、心肺复苏等［1-2］。程序性细胞死亡因子-1（programmed death-1，PD-1）作为一种免疫抑制受体能通过调控T 细胞的数量、功能、调节性T 细胞、免疫逃逸等免疫反应在肿瘤、自身免疫性疾病、慢性病毒感染等多种疾病中发挥重要作用。有研究［3-4］证实PD-1参与了巨噬细胞的极化过程。研究［5-6］表明，PD-1在肠、肝等器官的缺血再灌注损伤中都发挥重要作用。但是，PD-1是否参与LIRI尚未明确。本研究通过建立大鼠肺缺血再灌注的动物模型，期望探讨PD-1在LIRI 中的作用及其调控机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康成年雄性SD 大鼠30 只，体质量200～250 g，购自广西医科大学动物实验中心，动物许可证号：SCXK 桂2014-0003。

1.1.2 主要试剂 PD-1 抗体（英国Abcam 公司）；β-actin 抗体（英国Abcam 公司）；辣根酶标记驴抗山羊IgG（碧云天公司）；大鼠IL-1β ELISA KIT（武汉华美）；大鼠IL-4 ELISA KIT（武汉华美）；大鼠IL-6 ELISA KIT（武汉华美）；大鼠IL-10 ELISA KIT（武汉华美）；Rabbit Anti-CD11c antibody（北京博奥森）；Rabbit Anti-CD16 antibody（北京博奥森）；Rabbit Anti-Macrophage mannose receptor 1 antibody（北京博奥森）；Rabbit Anti-Arginase 1 antibody（北京博奥森）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理 将所有大鼠随机分成5 个组，分别是对照组、再灌注2 h 组、再灌注6 h组、再灌注24 h 组、再灌注72 h 组。大鼠10%水合氯醛0.5 mL/100 g 腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术台上，经口插入气管导管，固定气管导管，接动物呼吸机辅助呼吸（呼吸频率60 次/min，潮气量10 mL/kg，吸呼比1∶1，FiO2100%）。左胸前备皮消毒，沿第四肋间开胸，暴露肺门，以无损伤血管夹夹闭肺门1 h 后，松开动脉夹恢复供血和通气并逐层关胸，分别于2、6、24、72 h 后心脏取血处死动物［7］。大鼠正中开胸，暴露右心室，缓慢经右心室注入50 mL PBS 进行灌洗左肺直至发白，完毕后获取左肺组织，待检。

1.2.2 HE 染色观察肺损伤程度 肺组织置于4%的多聚甲醛固定，浓度梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切成5～8 μm 的切片置于载玻片上，贴片后进行HE 染色，在光镜下观察肺损伤程度，并进行肺损伤评分。

1.2.3 电镜观察肺组织的超微结构 将肺组织标本切成约1 mm 的小块，固定在3%的戊二醛中至少2 h 后，放在1%的锇酸中至少1～2 h，然后在不同浓度丙酮中进行脱水，再放入树脂中。样品用超薄切片切割成超薄切片。使用H-760 透射电子显微镜（H-760，东京，日本）观察超薄切片。

1.2.4 肺湿重/干重（W/D）比值检测肺水肿 取实验动物的左肺组织，置于滤纸上吸干组织表面液体后称重，记为湿重（W），之后将肺组织置于60 ℃烤箱96 h 至恒重，称重记为干重（D），肺组织湿重与干重的比值即为肺组织的干湿比（W/D）。

1.2.5 ELISA 法测IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10 取各组肺组织标本，按照ELISA 试剂盒说明书分别检测IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10 的表达水平。

1.2.6 Western Blot法检测肺组织PD-1蛋白表达参照SUN 等［8］的方法进行，使用RIPA 裂解液并加入磷酸酶抑制剂提取肺组织中的蛋白，用BCA 法检测蛋白浓度后，置于-80 ℃冰箱保存。制10%的聚丙烯酰胺凝胶加样电泳后转至PVDF 膜上，用5%的BSA 封闭2 h。PVDF 膜放在配制好的PD-1（1∶125），β-actin（1∶1 000）抗体中4 ℃过夜孵育。洗膜后置于1∶1 000 稀释的二抗中室温孵育1 h 之后用ECL 显影剂显影，经过电脑扫描成像。

1.2.7 免疫组化法测肺组织CD11c、CD16、CD206、Arg1 的表达 常规石蜡包埋并切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，3%H2O2灭活内源性过氧化物酶，柠檬酸法高压修复抗原；分别加入CD11c、CD16、CD206、Arg1 一抗，4 ℃孵育过夜；滴加生物素标记二抗，室温孵育10 min；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，室温孵育10 min；DAB 显色，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片，显微镜下观察染色情况。按细胞染色强度评分：无着色为0 分，淡黄色为1 分，棕黄色为2 分，深棕色或棕褐色为3 分。按阳性细胞百分率评分：阳性细胞百分率＜10%为0 分，10%～25%为1 分，26%～50%为2 分，＞50%为3 分。以上述两项评分乘积记为免疫组化评分，选5 个视野观察评分取均值。

1.3 统计学方法 数据结果以均数±标准差表示，使用SPSS 22.0 统计软件进行单因素方差分析，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织病理学变化 对照组的肺组织结构正常，肺泡间隔均匀一致，无间质充血，肺泡内腔未发现炎性细胞浸润。与对照组比较，缺血再灌注各组肺组织结构不同程度破环，再灌注2 h 组肺泡壁轻度增厚，肺间质水肿，有炎性细胞浸润；再灌注6 h 组损伤最严重，肺泡间隔不一，肺间质明显水肿，大量炎性细胞浸润；随后肺损伤程度逐渐降低。与对照组相比，各实验组肺损伤评分均上升（均P＜0.05）；其中，再灌注6 h 组肺损伤评分明显高于其他组。见图1。

图1 肺组织病理学变化（×100）及肺损伤评分Fig.1 Histopathology results of rat lung tissues and the score of lung injury（×100）

2.2 肺组织超微结构变化 对照组肺组织超微结构正常，可见完整的基底膜和Ⅱ型肺泡上皮细胞。Ⅱ型肺泡上皮细胞的微绒毛和板层小体明显。缺血再灌注各组肺组织微结构出现损坏，再灌注2 h 组Ⅱ型肺泡上皮细胞的微绒毛开始减少，再灌注6 h 组Ⅱ型肺泡上皮细胞微绒毛变得光滑且数目显著减少，板层小体稀少。再灌注72 h 组损伤减轻。见图2。

图2 肺组织超微结构变化（×10 000）Fig.2 The ultrastructural changes of lung tissues（×10 000）

2.3 W/D 值比较 与对照组比较，缺血再灌注各组W/D 值均增大（P＜0.05）；其中，再灌注6 h 组显著增大，肺水肿最严重。见图3。

2.4 肺组织IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10 表达比较与对照组比较，各实验组IL-1β（A）、IL-6（B）、IL-4（C）、IL-10（D）水平增高（P＜0.05）；其中，IL-1β、IL-6、IL-10 在再灌注6 h 组达到高峰，IL-4 水平在再灌注24 h 组表达最高。见图4。

图3 肺组织W/DFig.3 The ratio of wet-to-dry in lung tissue

2.5 肺组织PD-1 蛋白相对表达量比较 与对照组相比，再灌注各组PD-1 蛋白相对表达量均增高（P＜0.05），其中再灌注6 h 组表达最高。见图5。

2.6 肺组织CD11c、CD16、CD206、Arg1 的表达通过检测表面标记物的表达来探讨巨噬细胞极化是否与此相关，CD11c、CD16 是巨噬细胞M1 方向极化的表面标记物，CD206、Arg1 为M2 方向极化的表面标志物。与对照组比，再灌注6 h 组CD11c、CD16、CD206、Arg1 均表达增高（P＜0.05）。与再灌 注6 h 组 比 较，再 灌 注72 h 组CD11c、CD16、CD206、Arg1 均表达减少（P＜0.05）。见图6、7。

图4 肺组织IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10 表达Fig.4 The changes of IL-1β，IL-4，IL-6 and IL-10 level in lung tissues at different time points

图5 肺组织PD-1 蛋白相对表达量Fig.5 The changes of PD-1 expression in lung tissues（Western Blot）

3 讨论

图6 肺组织CD11c、CD16、CD206、Arg1 的表达（×100）Fig.6 The expression of CD11c，CD16，CD206 and Arg1 in lung tissues（×100）

图7 肺组织免疫组化评分Fig.7 The score of immunohistochemical in lung tissues

LIRI 是术后早期呼吸功能障碍的重要原因，严重的缺血再灌注损伤所导致的原发性移植物功能障碍是引起肺移植术后死亡的主要原因［9］。其特征性改变为肺水肿、微血管通透性增加、肺血管阻力增加、及肺动脉高压等。研究表明［10］，它的发生与炎症反应、氧化应激、促炎介质释放、细胞内钙超载、白细胞活化、细胞表面黏附分子上调、蛋白酶释放及保护性介质如肺泡表面活性物质和NO 减少等因素相关。炎症反应中，肺泡巨噬细胞分泌大量炎性细胞因子发挥重要作用，如IL-1β、IL-6 等可进一步激活中性粒细胞和内皮细胞，并产生氧自由基、NO，促进炎症加重损伤；而IL-10能减少TNF-α和IL-1β等炎性介质的释放，对肺泡巨噬细胞的过度炎症反应有抑制作用［11］。本研究通过血管夹完全夹闭左侧肺门1 h 后松开再灌注造模，从HE 染色和电镜观察可见再灌注2 h 组开始出现肺水肿，间质增厚，炎性细胞浸润。肺损伤的程度随时间的推移产生变化：在再灌注6 h 组可见浸润严重，间质明显增厚；再灌注24 h 组损伤缓解，但仍可见浸润；再灌注72 h 组损伤进一步减轻。同时，检测的炎症因子表达趋势也与肺损伤变化趋势相契合：IL-1β和IL-6 在再灌注6 h 组达到高峰，此时肺损伤也最严重，且IL-6 在再灌注24 h 组和72 h 组仍有高水平表达，提示此时促炎反应仍未完全消退；而IL-4、IL-10 在再灌注2 h 组开始升高，6 h 组高水平表达提示随着炎症进展，机体产生更多的抑炎因子抵抗促炎反应；随着IL-4、IL-10 的增多，IL-1β和IL-6 产生减少，肺损伤程度相对应减轻。

成熟巨噬细胞出现功能和表型分化的现象，称之为极化，按照其分泌的细胞因子以及表型的不同可分为经典活化巨噬细胞（M1 型）和选择性活化巨噬细胞（M2 型）两类。M1 型巨噬细胞分泌IL-6 等，其表面高表达CD11c、CD16，主要特点是促进炎症，参与正向免疫调节。M2 型巨噬细胞分泌IL-10 等，表面高表达CD206、Arg1，主要在抗炎、促进创伤修复和纤维变性及体液细胞免疫过程中发挥作用［12-14］。免疫组化观察可见肺组织中CD11c、CD16 在再灌注6 h 组表达增加，可知此时主要分泌促炎因子的M1 型巨噬细胞增多，导致肺炎症加重，损伤严重。同时CD206、Arg1 表达也增加说明随着损伤程度加重，M2 型巨噬细胞开始启动修复作用。

PD-1 是B7/CD28 超家族的共抑制成员，其在T和B 淋巴细胞上表达。研究表明其在一些病毒和细菌感染中发挥作用［15-17］。ZHANG 等［5］研究表明，CD4（+）T 细胞上的PD-1 表达变化参与肠缺血再灌注损伤的发病机制。JI 等［6］研究表明，PD-1通过抑制T 细胞活化和巨噬细胞功能来改善肝缺血再灌注损伤。本研究中，PD-1的蛋白相对表达量在再灌注2 h 组增高，72 h 组表达降低，其趋势与肺损伤变化相同。YAO 等［3］证实PD-1 在脊髓损伤中参与了巨噬细胞极化过程。YUAN 等［18］证明PD-1 通过调节纤维蛋白原样蛋白2 来减弱巨噬细胞活化和脑炎症。本实验发现PD-1 影响大鼠肺缺血再灌注损伤变化，其作用机制可能与巨噬细胞极化介导的炎症反应有关。

综上所述，PD-1 可能通过介导巨噬细胞极化参与的炎症反应来影响肺缺血再灌注损伤的变化。