Salubrinal 在ABT737 诱导的人肝癌细胞Sk-Hep1凋亡中的作用及机制

谢邹祺 代荣阳 张春燕

西南医科大学1肝脏疾病实验室，2基础医学院生物化学与分子生物学教研室（四川泸州646699）

肝癌是我国常见恶性肿瘤，目前临床治疗倾向于从单一转为多样化治疗［1-2］。ABT737是由美国Abbott 公司研究开发的一种Bcl-2 小分子抑制剂，可与Bcl-2/Bcl-XL 结合而拮抗其抗凋亡作用［3］。研究［4-6］发现ABT737 对多种癌细胞具有细胞毒性，可在卵巢癌、肺癌和膀胱癌等各种癌症类型中诱发显著的细胞凋亡。如石少敏等［7］发现ABT737可增加GSK3 抑制剂SB216763 引起的人非小细胞肺癌A549 细胞凋亡；王焕等［8］发现ABT737 可通过激活JNK/c-Jun 信号通路，从而使凋亡蛋白Bim 的表达上调，诱导人宫颈癌HeLa 细胞凋亡。因此，ABT737 对癌细胞的凋亡作用比较明确。

小分子化合物salubrinal 是一种化学合成剂，通过诱导真核翻译起始因子eIF2α51 位丝氨酸发生磷酸化而抑制真核翻译起始因子的活性［9-10］。如陈永华等［11］研究发现salubrinal 能够抑制铜负荷引起的肝细胞凋亡，具有干预PERK/eIF2α 信号通路作用；刘利娟等［12］发现在大鼠MCAO 缺血再灌注损伤模型中salubrinal 可下调LC3-Ⅱ的mRNA 表达及LC3-Ⅱ/LC3-ⅠmRNA 比值，进而改善神经功能缺损，起到神经保护作用。尽管目前的研究发现salubrinal 可抑制细胞凋亡［13-15］，但具体机制尚不清楚。

为了探索salubrinal 对人肝癌细胞株Sk-Hep1凋亡的影响及作用机制，本实验采用salubrinal 预处理人肝癌细胞株Sk-Hep1，再以ABT737 诱导癌细胞凋亡后，检测细胞凋亡的分子标记——剪切的PARP 表达、DNA 损伤的分子标记——磷酸化H2AX 蛋白表达以探索salubrinal 对ABT737 诱导的Sk-Hep1 肝癌细胞凋亡的影响。为了进一步探索salubrinal 抑制eIF2α51 去磷酸化水平的作用是否与这种相互作用相关，本实验检测了在ABT737诱导的Sk-Hep1 细胞凋亡中，salubrinal 作用后p-eIF2α、eIF2α蛋白的表达水平，并在联用ABT737和salubrinal 处理Sk-Hep1 肝癌细胞后，转染eIF2α的两种突变体即51 位丝氨酸不能磷酸化突变体（eIF2αS51A）以及51 位丝氨酸磷酸化突变体（eIF2αS51D）、质粒，进一步检测剪切的PARP、p-eIF2α 蛋 白 表 达 变 化，以 此 探 索salubrinal 对ABT737 处理后Sk-Hep1 的细胞的影响及与eIF2α通路的可能关系。

1 材料与方法

1.1 药品和抗体 Salubrinal 购自美国Santa Cruz公司，ABT737 购自美国Selleck Chemicals 公司，抗PARP、p-eIF2α 和磷酸化H2AX 一抗购自美国Cell Signaling Technology 公司，抗eIF2α 和GAPDH 一抗购自美国Santa Cruz 公司。Lipofectamine 2000 购自美国Thermo Fisher Scientific 公司，eIF2αS51A 质粒、eIF2αS51D 质粒、人肝癌细胞株Sk-Hep1 为实验室保存。

1.2 细胞培养 人肝癌细胞Sk-Hep1 用DMEM 完全培养基（含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素）培养于5% CO2，37 ℃孵箱。每隔2～3 d 换液，待细胞生长达到对数生长期时进行实验。本实验经过本单位伦理委员会的审批。

1.3 Western Blot 十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶（SDS-PAGE）电泳分离蛋白质，采用hoefer 半干电转移将蛋白分子转移到硝酸纤维素（NC）膜上，电转移结束后的NC 膜用Tris 盐酸缓冲液（TBST）洗涤3 次（5 min/次），封阻缓冲液（5%BSA）在室温下密闭轻摇封阻1 h。TBST 洗涤3次（5 min/次）后，NC 膜与一抗稀释液室温下轻摇动孵育30 min，4 ℃冰箱过夜，回收一抗，TBST 洗涤3次（5 min/次）。NC 膜与荧光二抗稀释液于室温下轻摇动孵育1 h，回收二抗，TBST 洗涤3次（5 min/次）。Odyssey-CLX扫描显影。

1.4 质粒转染 细胞接种于六孔板中，将2.5 μg的eIF2αS51A、eIF2αS51D 的储存液分别与100 μL Opti-MEM 混合，同时将8 μL Lipofectamine 2000 与100 μL Opti-MEM 混合，然后将两种溶液混匀并加入正常培养的Sk-Hep1 细胞中。培养6 h 后更换新鲜的完全培养基。

1.5 蛋白提取 根据实验分组，待药物处理达到预定时间后，弃掉六孔板中培养液，PBS 冲洗2 次，随即向各孔中加入适量含蛋白酶抑制剂的IP 裂解液（约100 μL），轻微晃动，使IP 裂解液覆盖所有细胞，将六孔板置于冰上约20 min。用细胞刮将细胞刮下并用1.5 mL EP 管收集，用超声波细胞粉碎冰上超声破碎细胞，超声3 次（5 s/次）。用4 ℃低温离心机12 000 r/min 离心15 min，取离心后上清液装入新的1.5 mL EP 管中，置于冰上。样品变性：根据EP 管中取得的蛋白样品总体积，加入1/5 总体积的5×蛋白loading buffer，充分混匀后，在100 ℃蜂窝炉煮变性5～10 min，最后放在冰上约3 min。

1.6 统计学方法 采用SPSS 16.0 软件分析数据，所有实验至少重复3 次，实验数据以均数±标准差表示。统计学比较采用t检验、单因素方差分析（One-Way ANOVA）。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ABT737 诱导Sk-Hep1 肝癌细胞凋亡及DNA损伤 采用不同浓度ABT737（0、2.5、5、10 μmol/L）刺激Sk-Hep1 肝癌细胞24 h 后，通过Western Blot检测分析剪切的PARP 蛋白及磷酸化H2AX 蛋白表达情况，结果显示，随着ABT737 浓度增加，剪切的PARP 蛋白（图1A）及磷酸化H2AX 蛋白表达（图1B）增加，并呈现浓度依赖性，差异具有统计学意义。这表明ABT737 促进了Sk-Hep1 肝癌细胞中细胞凋亡的分子标记——剪切的PARP 蛋白表达上调，同时也促进了DNA 损伤标志蛋白——磷酸化H2AX 蛋白的表达增加。依据现有文献［4-7］，结合本实验所用细胞对ABT737 的反应性，本研究从0、2.5、5、10 μmol/L 中选取了一个效果较为明显的浓度——5 μmol/L 来检测ABT737 对Sk-Hep1 肝癌细胞作用与时间的关系。采用5 μmol/L 的ABT737 处理Sk-Hep1 细胞6、12、24、36 h 后，Western Blot 检测分析剪切的PARP 蛋白及磷酸化H2AX 蛋白表达情况，结果发现，剪切的PARP 蛋白（图1C）及磷酸化H2AX 蛋白表达（图1D）增加，并呈时间依赖性，差异具有统计学意义。

图1 ABT737 上调Sk-Hep1 细胞中剪切的PARP 及磷酸化H2AX 蛋白水平Fig.1 ABT737 upregulated the cleavaged PARP protein and phosphorylated H2AX protein in Sk-Hep1 cells

2.2 Salubrinal 对ABT737 在肝癌细胞Sk-Hep1中诱导的细胞凋亡及DNA 损伤具有拮抗作用 采用salubrinal 对肝癌细胞Sk-Hep1 预处理1 h 后再联用ABT737（5 μmol/L），运用Western Blot 技术分别在ABT737 作用24、36 h 两个时间点检测剪切的PARP 蛋白表达（图2A）及磷酸化H2AX 蛋白表达（图2B）。统计学分析结果显示，salubrinal联用ABT737组与单用ABT737组相比，在24、36 h两个时间点上剪切的PARP 蛋白与磷酸化的H2AX 蛋白表达量均明显下调，差异有统计学意义。这表明salubrinal对ABT737在肝癌细胞Sk-Hep1中诱导的细胞凋亡及DNA损伤具有拮抗作用。

图2 联用salubrinal 与ABT737 可下调Sk-Hep1 细胞中剪切的PARP 及磷酸化H2AX 蛋白水平Fig.2 ABT737 combined with salubrinal down-regulated the level of cleavaged PARP and phosphorylated H2AX protein in Sk-Hep1 cells

2.3 Salubrinal对ABT737的拮抗作用可能与eIF2α通路无关 为了探索salubrinal对肝癌细胞Sk-Hep1中ABT737 的拮抗作用是否与其对eIF2α去磷酸化的抑制有关，本研究在肝癌细胞Sk-Hep1 中使用salubrinal 预处理1 h 后，ABT737（5 μmol/L）处理24、36 h，Western Blot检测p-eIF2α、eIF2α蛋白表达。统计学结果分析发现各组蛋白表达水平没有明显变化（图3A）。肝癌细胞Sk-Hep1 用lip2000 转染eIF2αS51A、eIF2αS51D 质粒后，ABT737（5 μmol/L）处理24、36 h 后，运用Western Blot 检测剪切PARP、p-eIF2α蛋白表达（图3B），统计学结果分析发现各组没有明显变化，差异无统计学意义。这说明salubrinal 减弱ABT737 诱导的凋亡以及DNA 损伤与eIF2α通路可能没有关系。

图3 Salubrinal 对ABT737 的拮抗作用可能与eIF2α通路无关Fig.3 The antagonism role of salubrinal against ABT737 may be unrelated to eIF2α pathway

3 讨论

剪切的PARP 蛋白是细胞凋亡的分子标记，而磷酸化H2AX 蛋白是DNA 损伤的标志蛋白，本研究证实了ABT737 这种小分子物质在Sk-Hep1 肝癌细胞中诱导了细胞凋亡和DNA 损伤。实验发现在不同浓度ABT737 作用下Sk-Hep1 肝癌细胞中的剪切PARP 及磷酸化H2AX 蛋白表达随着ABT737 浓度的增加而增加，呈现浓度依赖性（图1A、B）。本实验还根据文献［4-7］结合Sk-Hep1 细胞对ABT737 的反应性，选取了效果明显的浓度——5 μmol/L 来进一步检测ABT737 对Sk-Hep1 肝癌细胞诱导的细胞凋亡及DNA 损伤与时间的关系，发现ABT737 的这种作用呈现时间依赖性（图1C、D）。因此证实了ABT737 在Sk-Hep1 肝癌细胞中能够诱导的细胞凋亡及DNA 损伤，且这种作用呈现浓度和时间依赖性，这与他人报道的ABT737 在多种癌细胞中的细胞毒性作用结论一致［4-7］。

Salubrinal 是一种选择性eIF2α 去磷酸化抑制剂，通过磷酸化eIF2α 而活化eIF2α 通路，这导致应激反应通路的激活，表现出细胞保护作用［16-20］，salubrinal 在于抗癌药物联合使用时可以减弱或促进不同化疗药物的抗肿瘤作用，如顺铂和多柔比星［21-23］。目前的癌症治疗倾向于多药联合使用，而ABT737 是抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w 的一种强力抑制剂，具有协同细胞毒性，在卵巢癌、胆管癌、肺癌等多种癌症中均可诱导细胞凋亡［4-7，18］，是具有临床应用潜力的抗癌药物。本实验首次联合应用salubrinal与ABT737处理Sk-Hep1 肝癌细胞，发现联合应用两种药物导致剪切的PARP 蛋白表达量、磷酸化的H2AX 蛋白表达量都明显下调，这说明salubrinal 对ABT737诱导的细胞凋亡和DNA 损伤具有拮抗作用。本研究中检测到联合应用salubrinal、ABT737 处理Sk-Hep1细胞后p-eIF2α、eIF2α蛋白表达无明显变化，且转染eIF2αS51A、eIF2αS51D 质粒对ABT737诱导的PARP 剪切和p-eIF2α蛋白表达也无明显影响。综合上述，推测salubrinal 拮抗ABT737 诱导的Sk-Hep1 的细胞凋亡作用与eIF2α通路可能没有关系。

总而言之，本研究揭示了salubrinal 对ABT737诱导的细胞凋亡和DNA损伤具有拮抗作用，这提示临床上使用药物联合治疗肝癌细胞时应避免这两类药物同时应用，同时，本研究也探索了salubrinal这种拮抗作用涉及的相关通路蛋白，发现该作用可能与eIF2α通路无关。Salubrinal 与某些抗癌药物联合使用时具有增强抗癌药物的效果，如顺铂和多柔比星［21-23］，但在与某些抗癌药物联合应用时表现出的拮抗作用机制不甚清楚，尚需进一步扩大相关通路蛋白的检测以便了解其作用机制，并为临床应用提供理论基础。