基于鼻咽部黏膜细胞稳定性FH检测的联合检测手段在鼻咽癌早期诊断中的应用

邱烨, 张俊杰, 李殷, 葛益林, 宋喜, 周小娟, 宋辉

鼻咽癌在我国广东、广西、福建等省发病率高达25/10万～50/10万[1]。鼻咽癌易发于35～50岁男性,近年来发病年龄趋年轻化,女性病例亦显著增加。由于早期鼻咽癌临床症状不典型,加之解剖位置隐蔽,给诊断带来一定困难。早发现、早诊断、早治疗能显著改善患者预后,提高生存率及生活质量。因此,寻求一种对鼻咽癌早期诊断有实际意义的敏感检测方法至关重要。目前,临床上用于鼻咽癌的辅助检查主要有电子鼻咽镜、鼻咽部CT/MR、EB病毒血清学检查以及肿瘤标志物基因检测等。但这些手段步骤复杂且收费较高,存在特异性差、定位难、分诊难等诸多缺点。因此,探讨简便、易行、经济、有效的方法作为早期鼻咽癌的筛查手段迫在眉睫。我们采用鼻咽部黏膜细胞稳定性FH检测试剂盒,检测鼻咽癌前病变、鼻咽癌及鼻咽正常组织或良性病变患者鼻咽部黏膜细胞游离亚铁原卟啉,即细胞内游离血红素(free heme,FH)的含量,评价FH检测在诊断鼻咽癌及癌前病变中的临床意义,同时观察基于鼻咽部黏膜细胞稳定性FH检测联合鼻咽镜、EB病毒血清学检查策略在鼻咽癌早期诊断中的作用,比较3种方法诊断鼻咽癌的敏感性,以期为鼻咽癌患者提供敏感、可靠的诊断方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年1月至2018年6月在长沙市第一医院耳鼻喉科进行检查的可疑鼻咽癌患者303例作为研究对象,其中男159例,女144例。将最终经病理学检查诊断为鼻咽癌及癌前病变的患者189例作为观察组,另114例为正常或良性病变患者作为对照组。其中观察组年龄26～61岁,平均(47.37±15.41)岁。对照组年龄26～59岁,平均(45.54±15.67)岁。两组研究对象一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性,见表1。入选本研究的受试者均事先签署入组知情同意书,本研究经本院医学伦理委员会批准备案。

表1 患者一般资料两组间比较

变量对照组观察组P值 例数114189- 男性%(n/n)53.4(101/189)50.9(58/114)0.794 年龄(岁)45.54±15.6747.37±15.410.775 病程(年)2.61±0.942.46±0.990.265

1.2 方法

采集两组患者空腹时静脉血3 ml,3 000 rpm离心15 min,分离血清,-80 ℃保存待测。所有患者均行电子鼻咽镜、鼻咽部黏膜细胞稳定性FH检测、血清EB病毒VCA-IgA检查。对所有观察组及对照组鼻咽部可疑病变部位行病理活检。电子鼻咽镜检查及鼻咽部活检均由同一位耳鼻喉科副主任医师操作。观察3种方法诊断鼻咽癌的敏感性以及特异性。

1.2.1 鼻咽部黏膜细胞稳定性FH试纸检测 采样部位在取样前不得清洗、上药、搔刮,持鼻咽部黏膜渗液采样器从鼻咽部位缓缓插入,左右各旋转180°,再按鼻咽后壁、咽鼓管咽口、咽鼓管圆枕、咽隐窝的顺序擦拭,采集鼻咽部黏膜细胞渗液,充分蘸取后,把取样器头部放入C试剂内充分搅动,使所采标本与C试剂充分混匀,静置10 s后,当即检验。检测方法如下:① 将A试剂滴管管口两翼部顺时针旋转折断,把试剂准确滴入测试池;② 用已空置的A试剂滴管在C试剂内吸取样本液不少于1 ml，准确滴入测试池;③ 旋转折断B试剂滴管,把试剂准确滴入测试池;④ 操作完毕后,120 s内将测试池内标本的显色与比色板进行比对。如果测试池的显色为不变色,则判定为阴性;显示蓝色、绿色、蓝绿色则判定为阳性;若先显示上述某种颜色,后转为深黄色或棕红色,表明样本内混有血液,应按照先出现的颜色进行结果判读(深黄色或棕红色是血液的征象)。

1.2.2 电子鼻咽镜检查 所有患者取仰卧位,采用德国WOLF牌电子鼻咽镜进行检查。检查前采用丁卡因溶液对鼻黏膜进行麻醉,采用麻黄素溶液收缩鼻甲,从鼻腔内探入电子鼻咽镜检查咽隐窝、鼻咽侧壁、后壁、咽鼓管圆枕及咽口等部位[2]。仔细观察各检查部位形态及病灶累及范围,鼻咽部有隆起、肿胀、糜烂、坏死或浸润者为阳性,鼻咽部形态光滑、对称者为阴性。

1.2.3 EB病毒VCA-IgA检测 采用北京贝尔生物工程有限公司生产的VCA-IgA Elisa检测试剂盒进行检测,所有操作均按照试剂盒说明书进行。采用酶标仪在450 nm/630 nm处检测各孔吸光度数值,OD值≥0.15为阳性。

1.3 观察指标

统计3种检查方法单独运用、任意2种联合检测以及3种联合检查的阳性率。2种检查方式结果皆为阳性记为联合检测阳性,2种检查方法中有1种结果为阴性记为联合检查阴性;3种检查方法结果皆为阳性记为三者联合检查阳性,至少有1种结果为阴性记为三者联合检测阴性。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 3种检查方法单独运用对鼻咽癌的诊断价值

本研究共纳入303例临床症状可疑鼻咽癌患者,最终经鼻咽活检病理确诊鼻咽癌189例,其中鼻咽部黏膜细胞稳定性FH检测阳性170例;EB病毒血清学检查发现EB病毒VCA-IgA阳性160例;电子鼻咽镜检查诊断鼻咽癌157例。单独运用鼻咽部黏膜细胞稳定性FH检测、EB病毒VCA-IgA检测以及电子鼻咽镜对鼻咽癌诊断的敏感性分别为89.9%(170/189)、84.7%(160/189)、83.1%(157/189),以鼻咽部黏膜细胞稳定性FH检测的敏感性最高;3种检查方法对鼻咽癌诊断的特异性分别为80.7%(92/114)、77.2%(88/114)、81.6%(93/114),以电子鼻咽镜特异性最高。

2.2 任意2种方法联合检查对鼻咽癌的诊断价值

鼻咽部黏膜细胞稳定性FH检测联合电子鼻咽镜检查诊断鼻咽癌151例;鼻咽部黏膜细胞稳定性FH检测联合EB病毒血清学检测诊断鼻咽癌157例;电子鼻咽镜联合EB病毒血清学检测诊断鼻咽癌148例。鼻咽部黏膜细胞稳定性FH检测联合电子鼻咽镜检查、鼻咽部黏膜细胞稳定性FH检测联合EB病毒血清学检测以及电子鼻咽镜联合EB病毒血清学检测对鼻咽癌的诊断敏感性分别为79.9%(151/189)、83.1%(157/189)、78.3%(148/189),特异性分别为93.9%(107/114)、91.2%(104/114)、88.6%(101/114)。其中以鼻咽部黏膜细胞稳定性FH检测联合EB病毒血清学检测敏感性最高;鼻咽部黏膜细胞稳定性FH检测联合电子鼻咽镜检查特异性最高。

2.3 3种方法联合检查对鼻咽癌的诊断价值

3种方法联合检查诊断鼻咽癌146例,敏感性为77.2%,特异性为93.9%。

3 讨论

目前,鼻咽癌是治愈率较高的肿瘤之一,对放射治疗十分敏感,患病早期只需进行以放射治疗为主的综合治疗,90%以上都可痊愈,但多数患者初诊时即为晚期,导致高死亡率。局部复发和远处转移是导致鼻咽癌治疗失败的主要原因[3-4],因此早期诊断非常重要。鼻咽癌患者的主要表现为回缩涕中带血或擤鼻涕中带血,耳闭塞感,听力下降以及颈部淋巴结肿大等。对表现为上述症状的可疑鼻咽癌患者进行必要的辅助检查是对鼻咽癌进行早期诊断和鉴别诊断不可或缺的。长期以来,临床上关于早期鼻咽癌的无损检测方法一直匮乏。目前应用最多的主要是电子鼻咽镜、鼻咽CT/MR以及EB病毒血清学检查[5]。活组织病理检查是诊断鼻咽癌的金标准,但操作复杂繁琐且需要取活体组织,因此不宜作为常规的筛查手段。

FH物质是细胞游离亚铁原卟啉的简称,它广泛存在于人体的每个细胞内。FH位于线粒体底端,并广泛存在线粒体内,而线粒体是人体各器官正常运行的必需功能场所。作为1种效应性生物标志物,通过与不同蛋白质结合FH能发挥不同的生理功能。在肿瘤的发生过程中,原癌基因激活、抑癌基因(特别是p53)突变或缺失[6]发挥重要作用。在致癌因子的共同作用下,细胞代谢周期紊乱,蛋白构像发生变化。随后,FH物质在细胞蛋白中脱落,从细胞中析出,成为细胞游离亚铁原卟啉。作为1种活性基团,游离的FH物质能促进羟自由基、氧自由基以及亚硝基自由基的生成,催生级联性电子传递连锁反应(为了维持自身稳态,不稳定的羟自由基会从邻近的脂肪、蛋白质和DNA分子上夺取电子,而失去电子的邻近分子又会进一步从旁边的分子夺取电子,如此连锁反应)，最终导致细胞膜脂质、脂蛋白、细胞骨架、DNA等氧化损伤,细胞自身调控紊乱,发生癌变。肿瘤组织从癌前病变逐渐发展为浸润癌、转移癌的过程中,细胞损伤不断加重,导致溶酶体内蛋白水解酶不断溢出,细胞自溶加重,FH物质渗出且与上皮细胞的恶变程度成正相关。因此检测血清中FH的含量可以提示细胞恶变的严重程度。本研究中,单项采用FH试纸检测的敏感性和特异性分别为89.9%和80.7%,相比EB病毒VCA-IgA检测的84.7%、77.2%和电子鼻咽镜检查的83.1%、81.6%,FH检测的敏感性较高,而特异性略低于电子鼻咽镜。FH检测技术采用直接生物学介质-细胞渗液作为检测标本,在定性检测基础上同时可以实现靶向定位检测,因而用以检测恶性肿瘤的特异度高;与此同时,相比电子鼻咽镜以及病毒学检测,FH检测采用POCT(床边诊断)技术,具有快速、经济、简便、准确等优点,只需60～120 s即可出结果,因此在临床上具有更广泛的应用价值。我们的研究发现,鼻咽部黏膜细胞稳定性FH检测方法具有较高的敏感性和特异性,因此可作为鼻咽癌早期筛查的可靠检查手段。

EB病毒属于γ疱疹病毒科,成人感染率可高达95%以上。与EB病毒相关的恶性肿瘤包括血液系肿瘤和非血液系恶性肿瘤[7],鼻咽癌是首个被发现与EB病毒感染相关的人类肿瘤。1966年,Old等[8]采用免疫扩散试验的方式首次证实EB病毒与鼻咽癌密切相关,随后国内外学者开展了一系列的研究[9-10]。1999年,国际癌症研究中心首次将EB病毒明确列为人类致癌(尤其是鼻咽癌)因子之一。采用病毒和免疫学技术对早期诊断和发现鼻咽癌以及癌前期病变非常重要,然而其特异性却较低。本研究中,189例病理检查确诊为鼻咽癌的患者中,有160例血清EB病毒VCA-IgA检测表现为阳性,其阳性率达到84.7%,与既往文献[11]报道的基本一致。但由于该方法的特异性较低,存在一定的假阳性,因此增加了临床的工作量,也给部分受检者带来不必要的精神、心理上的压力和经济负担,因此限制了其在临床上的应用。

电子鼻咽镜因其能在直视下检查鼻咽部且有放大作用,为鼻咽癌的诊断提供1种可靠的诊断方法,目前广泛应用于具有新生异物的可疑患者的诊断。但由于其对操作者要求较高,需要熟练的操作技能且长期的临床经验,费用相对较昂贵,不适于早期鼻咽癌的筛查。本研究中,电子鼻咽镜检查诊断鼻咽癌的敏感性和特异性分别83.1%和81.6%,相比FH检测技术、EB病毒血清学检测其特异性最高,但由于该方法不能发现黏膜下病变,故也存在一定的假阴性率。

近年来,国内外有很多联合检查手段用于鼻咽癌筛查和诊断的报道。本研究中,采用任意两种检查方法联合检查的结果显示,以FH检测联合EB病毒VCA-IgA检测的敏感性最高(83.1%),而特异性最高的为电子鼻咽镜联合FH检测(特异性为93.9%)。三者联合检查诊断的特异性显著提高,达到93.9%,但其敏感性显著降低(仅为77.2%),且三者联合检查步骤繁琐、费用高,因此不建议临床用于早期鼻咽癌的筛查。综合检查成本、检查效率(诊断敏感性和特异性),我们认为采用FH检测联合EB病毒VCA-IgA检测筛查早期鼻咽癌最为合适,其敏感性可达到83.1%,特异性可达到91.2%。相比单独检测以及其他联合检测方法其敏感性和特异性都相对较高。并且,EB病毒VCA-lgA检测已经确定为鼻咽癌的筛查指标,具有诊断参考意义。本研究利用鼻咽部黏膜细胞稳定性FH检测联合EB病毒VCA-lgA检测的方法提高了对鼻咽癌检测EB病毒VCA-lgA单一指标的特异性,有一定的应用价值。与此同时,FH检测联合EB病毒VCA-IgA检测的方法操作相对简单,在临床上具有推广价值。

综上所述,本研究认为因鼻咽部黏膜细胞稳定性FH检测联合EB病毒VCA-IgA检测的方法对早期鼻咽癌的诊断具有较高的敏感性和特异性,对鼻咽癌的早期诊断具有重要意义,可作为鼻咽癌早期诊断的方法。