循环肿瘤细胞研究进展

王建， 邵荣金， 龚伟达

1869年，Ashwort对1例癌症死亡患者进行尸检时发现其外周血存在类似的肿瘤细胞，首次提出了循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTC)这一概念[1]。CTC是指由癌灶组织细胞脱离原发灶或转移灶释放进入外周血液循环的肿瘤细胞，进一步研究把CTC分为4类，单个游离的上皮样 CTC、干细胞样CTC、间质样CTC、CTC细胞簇。这部分细胞在肿瘤血行转移中起着重要的作用。近年来，有研究发现微转移是肿瘤远处转移的早期事件[2]，而CTC可能是远处转移的基础[2]。一般情况下，入血的肿瘤细胞往往被免疫细胞杀死，而有些处于休眠状态的肿瘤细胞，可以逃逸免疫系统的监视，待患者免疫力较低或在某些刺激下再次复苏，转移到远处脏器存活并增殖，最终形成肉眼可见的转移癌灶[4]。有研究表明，CTC的半衰期只有1.0～2.4 h，仅有0.01%存活且具有侵袭性的CTC在合适环境下穿出血管定植于远端形成转移灶[5]。肿瘤转移是一个多步骤多因素的复杂过程，而CTC的形成是实现肿瘤远处转移的基础。目前关于恶性肿瘤远处转移的机制存在两种观点，一种是“肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSC)理论”，认为原发癌灶中存在具有干细胞特性的肿瘤细胞，具有自我更新、单克隆增殖和分化的能力；另一种理论认为，恶性肿瘤的某些突变基因决定了肿瘤细胞的侵袭性，其远处转移和原发病灶的增殖同时进行[6]。对于已经形成转移灶的恶性肿瘤，由于肿瘤细胞异质性，转移灶及原发灶的细胞可能存在不同的表型，而CTC不仅来源于肿瘤原发灶，还来源于转移瘤灶，故CTC检测能较好地反映机体肿瘤细胞类型的整体情况。

1 循环肿瘤细胞的生物学特征

CTC生物学行为与血行转移密切相关。近年来，CTC与CSC间的关系已被研究证实[7-8]，提示CTC具有CSC的高度侵袭和转移潜能。CTC在外周循环血液的含量，可能受肿瘤细胞释放入血的时间(随机释放或类似于激素分泌的周期性规律释放[9])、人体免疫水平、肿瘤侵袭特性等因素的影响。肿瘤细胞侵袭入血包含以下几个步骤：肿瘤细胞生长、新生血管形成、瘤细胞脱离瘤体、上皮样-间叶样细胞转变(epithelial to mesenchymal transition，EMT)、癌细胞血管内渗、细胞播散、癌细胞滞留于器官、渗出、增殖及远处转移灶形成；所以肿瘤新生血管及血管微环境对肿瘤转移起着重要的作用[10]。CTC在穿过基底膜形成远处转移灶过程中，EMT形态的改变和重新获得的增殖能力在转移过程中发挥重要作用且具有高度侵袭性。研究表明，发生EMT的CTC其上皮细胞标志物，如细胞角蛋白、钙黏蛋白等表达下调，而间充质细胞的标志物，如基质金属蛋白酶、弹性蛋白等显著上调，这也是导致此类CTC生物学行为发生改变的重要原因。由于肿瘤细胞生存的微环境改变、血流剪切力的作用及外周血中免疫细胞的作用，绝大多数CTC发生凋亡，只有极少数细胞能存活下来并在合适条件下重新穿出血管，最终在适宜的器官形成肉眼可见的转移[11]。从模型估计每克肿瘤组织每天约1×106肿瘤细胞进入血液，有一部分凋亡CTC不能形成继发器官的转移[12]。

2 循环肿瘤细胞检测的临床意义

CTC检测的临床意义主要体现在以下几个方面：① 早期发现微转移：Sastre等[13]用 CellSearch 系统监测结肠癌患者，证实其CTC阳性率与原发肿瘤部位、肿瘤分化程度及CEA升高水平无关，但与结肠癌的临床分期相关，且CTC在结肠癌的早期阶段即可检测到，表明CTC检测有助于早期发现结肠癌及可能出现的微转移；② 评估预后：Cristofanilli等[14]在一项多中心、前瞻性、随机双盲临床试验中，检测177例转移性乳腺癌患者7.5 ml外周血中CTC的数量，发现治疗前外周血中CTC≥5个/7.5 ml外周血患者与CTC<5个/7.5 ml外周血患者相比，预后较差，CTC可作为转移性乳腺癌患者预后评估的独立预测因素；③ 指导个体化治疗：CTC计数和分子分型不仅能精确地预测疗效、判断预后，而且还可作为一种实时活检工具，为制定个体化治疗方案提供依据[15]。Meng等[16]应用FISH技术发现，38%转移性乳腺癌患者原发肿瘤组织HER-2呈阴性，而分离并富集的外周血CTC能够扩增到HER-2基因，根据CTC的HER-2扩增情况适时调整治疗方案，能获得更好的疗效。监控CTC的HER-2基因表达，进行个体化有针对性的治疗是对乳腺癌患者传统治疗观念的改进。

3 循环肿瘤细胞检测技术

由于CTC在外周血的数量极其稀少，通常每1×106～1×107个单核细胞中才会发现一个CTC，因此对CTC检测技术的灵敏度和特异度提出了极高要求。CTC检测包括两大技术环节，即细胞富集技术和细胞鉴定技术。

3.1 循环肿瘤细胞的富集技术 ① 基于分子免疫学检测技术，主要包括细胞检测体系(CellSearch System)、CTC-Chip(微量CTC微流体硅芯片)、CTC-PCR、免疫磁性细胞分选仪(MACS)、AdnaTest癌细胞检测系统、莱尔系统等，其中CellSearch系统于2004年通过美国食品与药品监督管理局(FDA)批准而上市，是目前唯一市场化用于CTC检测的技术设备[17]。也是目前临床和科研应用最广的方法。该技术的优势在于特异度较高，主要缺点是灵敏度不高，因上皮间质转化现象使上皮特异性抗原EpCAM、CKs 弱表达或不表达的肿瘤细胞容易被漏检[18]。其工作原理用Ep-CAM标记磁珠对上皮细胞进行富集，细胞经固定后用4，6-二眯基-2-苯基吲哚(DAPI)荧光染料标记细胞核，CD45荧光抗体和CKB、CK18、CK19或CKmix荧光抗体标记细胞，结果分析在四色荧光显微镜下进行。将DAPI+、CD45-、CK+、Ep-CAM+细胞定义为CTC。根据磁性细胞分选策略不同，大致分为：阳性富集法和阴性富集法。前者是通过磁珠偶联上皮细胞黏附分子(Ep-CAM)、细胞角蛋白(Cytokerins，CKs)等标志直接富集外周血中上皮来源的稀有细胞。由于阳性富集法主要利用肿瘤细胞的上皮细胞源性，故该方法只适用于EpCAM，Cytokerins，CKs表达量较高的肿瘤类型[19]，此外，该方法无法排除外周血良性上皮细胞的污染及被血小板包被的CTC等干扰所导致的假阳性和假阴性。阴性富集法是通过磁珠偶联CD45等白细胞标志去除外周血白细胞而间接富集稀有上皮细胞[20]。此方法能够避免因免疫磁珠运动造成的CTC被破坏，且不依赖CTC表面抗原表达，同时也不受EMT影响，但其步骤较多，CTC破碎率较高。②基于细胞密度的分离法，密度梯度离心法是利用配制的分离液密度将不同密度的细胞区分在不同区域。将外周血平铺于分离介质上层，离心作用加速密度大于分离液的细胞沉降，而密度小于分离液的细胞则聚集于分离液面上层，从而达到分离效果。常用的分离介质密度为1.077 g/ml，红细胞、粒细胞密度比其大，离心后会沉于管底；淋巴细胞和单核细胞密度小于或等于分离介质，离心后会漂浮于分离介质上层或悬浮于介质中，肿瘤细胞也是留存于单核细胞富集层。有时候，肿瘤细胞会迁移入血浆成分，于是产生了新的改进技术 OncoQuick[21]，即在梯度离心介质上安置一层多空膜屏障，这样可在离心前延滞血液样本的循环肿瘤细胞扩散，减少了肿瘤细胞丢失。但是这样得到的循环肿瘤细胞同大量白细胞和单核细胞混在一起，降低了后期鉴别CTC效率。此方法操作简单，成本低廉，分离出的CTC仍有活性，便于后续研究。③基于CTC直径大小的滤过膜分离法，以ISET系统为代表，ISET最早由Vona 等[22]提出，工作原理是CTC直径一般>10 μm，而正常血细胞(包括红细胞、白细胞)、淋巴细胞直径一般<8 μm，因此利用孔径为8 μm滤膜过滤预先固定的外周血后，体积较小的血细胞能被滤过而体积较大的CTC则截留富集在滤膜上。该方法的优点是操作简便、价格低廉、分离富集后的CTC仍保留活力，能用于FISH、PCR等后续研究。缺点在于有可能漏检体积较小的肿瘤细胞，目前CTC形态学鉴定缺乏统一标准[23]。

3.2 循环肿瘤细胞的鉴定技术 ① 免疫细胞化学法(immunocytochemistry，ICC)，是目前评价CTC检测方法“金标准”。通过特异性抗体与CTC特异性抗原(如CK、AFP等)发生的抗原抗体反应和细胞化学呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量分析。该技术能较好地观察细胞形态学并计数，缺点是敏感性低，只能从1×105～10×105个细胞中发现1个CTC，且可能由于肿瘤细胞特异抗原表达的不稳定性造成假阴性结果。② 流式细胞分析法，应用CTC特异性结合荧光显色剂使CTC染色，再利用流式细胞仪进行分析，同时能测定细胞形态、DNA及蛋白质含量，还能对CTC理化特性等多种参数进行分析。③ 反转录聚合酶链反应(RT-PCR)，是以肿瘤细胞表达特定的mRNA(正常外周血细胞不表达)来检测CTC，当外周血中检测到该mRNA时可间接提示CTC的存在。该法敏感性、特异性均较高，但其准确性受外周血样本上皮细胞污染、假基因干扰及CTC标志物异常表达等因素影响。由于检测过程需破坏CTC，因此无法对细胞进行计数及形态学观察。④ 激光扫描细胞计数法，利用高通量细胞分析仪，以激光为光源，具有图像细胞仪及流式细胞仪的功能，通过连续扫描荧光显微镜自动分析图像数据，可在较短时间内(0.5～1.0 h)自动检测5×104个细胞，并能对CTC内部微结构进行定性、定位及定量分析。⑤ 生物芯片技术，以悬浮阵列技术为代表，该法敏感性及特异性较高，也不需要大量血标本，可用于多种抗体联合分离CTC，并能根据CTC分子表型更精确分离CTC，对后续研究提供方便，但其结构复杂，成本较高，限制其在临床开展。⑥ 形态学鉴定，根据肿瘤细胞与正常细胞的形态学差异来鉴定CTC。该方法能较好地观察细胞形态学且结果易于长期保存，但目前CTC的鉴定较大程度依赖于病理学医生的经验，尚无形态学诊断金标准[24]。

此外，还有报道应用单细胞全基因组测序技术，在单细胞水平上对CTC进行全基因组扩增并测序从而分析CTC的基因突变或基因组异常[25]。通过腺病毒携带GFP的标记技术，结合端粒酶标志，能通过生物影像技术检测外周血中具有活性的CTC[26]。应用上皮免疫斑点法，检测CTC在短时间体外培养中所分泌或释放的特异性蛋白质，从而评估CTC的生物学功能[27]。

4 循环肿瘤细胞的临床应用现状

4.1 循环肿瘤细胞检测评估患者病情及预后 研究表明，CTC可成为一种新的诊断工具，更早为肿瘤的分期、预后(较少的CTC预示着较长的生存期)以及疗效的评估提供信息。CTC检测作为一种非侵入性检查方法，还可对原发部位肿瘤和转移部位肿瘤的生物学特性提供信息。在前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、肝细胞癌、膀胱癌等一系列实体肿瘤中都发现存在CTC，CTC正成为肿瘤患者预后和对治疗反应的独立预测因素[28-31]。在乳腺癌方面，CTC的数目(以≥5个CTC/7.5 ml外周血为阈值)已证实是独立预后指标，可很好地预测转移性乳腺癌患者的无进展生存期(progression-free survival，PFS)和总生存期(overall survival，OS)。对于接受一线治疗的结直肠癌患者，CTC在治疗前后的数量变化可作为患者PFS和OS预测指标[32]，但对于接受三线治疗的晚期结直肠癌患者，CTC数量变化仅可作为OS预测指标，而对PFS预测意义不大，≤3个CTC/7.5 ml外周血的患者OS更长[33]。对于接受一线化疗的进展期胃食管腺癌患者，Sclafani[34]等的研究表明，外周血≥2个CTC的患者对化疗反应较差、生存时间更短。相比于传统影像学而言，CTC检测相对时间更早，结果也更准确[35]。

4.2 循环肿瘤细胞检测用于选择制定个体化治疗方案 随着人们对CTC分子生物学特性研究的不断开展，CTC检测已不局限于恶性肿瘤的无创诊断和预后预测，更重要的是可用于指导制定个体化的治疗方案。近期有学者在转移性乳腺癌研究发现，只有组织和CTC的HER-2均为阳性的患者才能从抗HER-2治疗中获益。相反，高达51.9%患者CTC的HER-2为阴性，而这些患者不太可能从抗HER-2治疗中获益[36]。因此，通过分析CTC分子分型，为肿瘤患者选择个体化治疗方案提供依据。Meyer等[35]研究表明，对于早期乳腺癌患者，31%患者外周血CTC阳性，且外周血CTC数量与有无淋巴结转移、肿瘤体积大小、肿瘤分级、肿瘤组织学类型和激素受体状态都没有明显的关系；在患者接受治疗后，大部分CTC阳性患者CTC转阴，目前恶性肿瘤患者治疗期间CTC数目的动态变化，已作为评价当前疗效与患者病情进展的良好指标。Kalykaki等[38]在吉非替尼治疗转移性乳腺癌患者研究中发现，治疗第2个周期后，约70.6%患者CTC计数减少了94.1%，证明吉非替尼治疗转移性乳腺癌的有效性。Gabriel 等[39]针对430例转移性结直肠癌患者，在治疗后3～5周检测CTC，发现治疗后疾病进展患者中CTC≥3个/7.5 ml者占73%，而治疗后疾病稳定或好转者中仅7%患者CTC≥3个/7.5 ml，同时指出CTC评价疗效的准确性达到78%。影像学和CTC联合检测能更好地对患者生存进行评估预测。Mark等[40]观察了不同分期的结直肠癌患者CTC表达谱的系统性变化。90%非转移性患者CTC中呈现表皮生长因子受体(EGFR)表达，而在转移性患者中仅有15%呈现EGFR表达。在接受原发手术患者中CTC的CEA表达较低(15%)，而转移性患者CTC中80%呈现CEA表达，指出CTC分子谱可作为个体化治疗中鉴别治疗靶，如HER-2或EGFR。

5 结语

CTC检测可用于多种实体恶性肿瘤的无创诊断，能够反映恶性肿瘤的转移、侵袭、复发，预测肿瘤患者预后，评价肿瘤患者疗效，辅助制定个体化治疗方案，鉴定抗肿瘤药物的临床价值。随着标准化、有效富集和鉴定实体瘤外周血CTC方法的建立，CTC转移的分子机制进一步阐明，大样本多中心的CTC临床试验验证，CTC可为实体瘤的诊疗提供新的工具。