胃癌组织lncRNA MEG3、GAS5表达变化及其与患者临床病理特征和预后的关系

徐瀚斌，章由贤，刘放，高晓慧，朱以祥

(湖北省中西医结合医院，武汉430015)

胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，由于其早期症状不典型，大部分患者确诊时已处于进展期，常伴有淋巴结或腹腔脏器转移，预后较差，5年总生存率不足10%[1]。但目前对胃癌发病的分子机制尚不完全清楚。长链非编码RNA(lncRNA)是一类转录本长度超过200 nt的RNA分子，它们并不编码蛋白，但可与DNA、RNA或蛋白质相互作用，通过基因印记、染色质重塑、细胞周期调控等机制，参与基因表达调控。近年研究发现，多种肿瘤组织中lncRNA异常表达，并与肿瘤的发生、发展密切相关[2，3]。母系表达基因3(MEG3)是第一个被发现具有抑癌基因功能的lncRNA，可通过抑制肿瘤血管生成，阻止肿瘤恶性进展。有研究报道，在肺癌、宫颈癌等组织中MEG3表达缺失，其表达缺失可促进肿瘤血管生成，继而导致肿瘤恶性进展[4]。生长特异抑制物5(GAS5)亦为近年发现的、具有肿瘤抑制功能的lncRNA。已有研究报道，在乳腺癌、前列腺癌等组织中GAS5低表达，其低表达可促进肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移[5]。但目前鲜见胃癌组织MEG3、GAS5表达的报道。为此，本研究观察了胃癌组织MEG3、GAS5表达变化，并分析其表达变化与患者临床病理特征和预后关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2012年7月～2014年12月湖北省中西医结合医院收治的胃癌患者73例。所有患者经术后病理或活检病理检查明确诊断。纳入标准：①符合胃癌诊断，且病理学类型为腺癌；②初诊，入院前未行任何抗肿瘤治疗；③临床病理资料和随访资料完整。排除标准：①非胃腺癌或病理学类型难以判断者；②合并其他部位恶性肿瘤或重要器官功能不全者；③临床病理资料或随访资料不完整者。其中，男42例、女31例，年龄32～75(55.42±16.31)岁；肿瘤直径：<5 cm 37例，≥5 cm 36例；组织分化程度：低未分化39例，中高分化34例；临床分期：Ⅰ、Ⅱ期38例，Ⅲ、Ⅳ期35例；有淋巴结转移43例，无淋巴结转移30例。本研究经湖北省中西医结合医院医学伦理委员会批准，患者或其家属知情同意。

1.2 MEG3、GAS5表达检测 采用real-time PCR法。取胃癌组织及其配对的癌旁正常组织(距肿瘤组织边缘≥5 cm)，采用TRIzol法提取组织总RNA，经紫外分光光度计鉴定，OD260/OD280为1.8～2.0，表明提取的总RNA纯度合格，可用于后续实验。采用AMV逆转录酶将总RNA逆转录为cDNA，-80 ℃保存。以cDNA为模板，按荧光定量PCR试剂盒说明进行PCR扩增。所有引物由武汉华联科生物技术有限公司设计合成。引物序列：MEG3上游引物5′-CTGCCCATCTACACCTCACG-3′，下游引物5′-CTCTCCGCCGTCTGCGCTAGGGGCT-3′；GAS5上游引物5′-CTTCTGGGCTCAAGTGATCCT-3′，下游引物5′-TTGTGCCATGAGACTCCATCAG-3′；GAPDH上游引物5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′，下游引物5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′。PCR反应体系共20 μL：1 μmol/L的上下游引物混合物0.5 μL，cDNA 1 μL，Taq酶0.5 μL，SYBR-Green 1 μL，Buffer 2 μL，dNTPs 1 μL，去离子水14 μL；反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s、60 ℃退火60 s、60 ℃延伸60 s共40个循环。每个样品设3个复孔。采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.3 随访 所有患者术后采用门诊、电话等形式定期随访，随访截至2018年5月，随访时间9～66个月、中位随访时间32个月，统计患者生存时间和术后3年生存率。以胃癌组织MEG3、GAS5相对表达量的均值为临界值，高于临界值作为高表达，低于或等于临界值作为低表达。比较MEG3、GAS5高表达者与低表达者生存时间和术后3年生存率。

2 结果

2.1 胃癌组织与癌旁正常组织MEG3、GAS5表达比较 胃癌组织与癌旁正常组织MEG3相对表达量分别为0.71±0.26、1.16±0.32，GAS5相对表达量分别为0.62±0.34、1.11±0.42。胃癌组织MEG3、GAS5相对表达量均明显低于癌旁正常组织(t分别为-9.325、-7.748，P均<0.05)。

2.2 胃癌组织MEG3、GAS5表达与患者临床病理特征的关系 胃癌组织MEG3、GAS5表达与肿瘤组织分化程度、临床分期和淋巴结转移有关(P均<0.05)，与患者性别、年龄、肿瘤直径无关(P均>0.05)。见表1。

2.3 胃癌组织MEG3、GAS5表达与患者预后的关系 MEG3高表达者与低表达者分别为36、37例，其术后生存时间分别为(39.94±12.13)、(32.11±10.24)个月，术后3年生存率分别为83.33%(30/36)、62.16%(23/37)，二者术后生存时间和术后3年生存率比较差异均有统计学意义(t/χ2分别为2.983、4.112，P均<0.05)。GAS5高表达者与低表达者分别为38、35例，其术后生存时间分别为(39.45±15.56)、(32.28±10.19)个月，术后3年生存率分别为84.21%(32/38)、60.00%(21/35)，二者术后生存时间和术后3年生存率比较差异均有统计学意义(t/χ2分别为2.308、5.369，P均<0.05)。见图1、2。

表1 胃癌组织MEG3、GAS5表达与患者临床病理特征的关系

图1 不同MEG3表达者生存曲线

图2 不同GAS5表达者生存曲线分析

3 讨论

我国是胃癌的高发国家，每年新发病例达40万例，占全世界的50%以上，已成为威胁我国居民生命健康的重要疾病之一。由于胃癌早期症状缺乏特异性，多数患者确诊时已处于进展期，预后较差。但目前对胃癌发病的分子机制尚不清楚。

lncRNA是一类转录本长度超过200 nt的RNA分子，它们并不编码蛋白，以往被认为是基因转录过程中的“噪音”，不具有生物学功能。随着基因组学研究的深入发现，lncRNA可在表观遗传、转录及转录后水平调控基因表达，并参与肿瘤的发生、发展[6]。MEG3是小鼠母系印记基因GTL2的人类同系物，定位于人染色体14q32.3，长度约1.6 kb，仅表达于母源性基因，是第一个被发现具有抑癌基因功能的lncRNA。MEG3在正常组织中广泛表达，尤其在脑、卵巢等组织中表达较高[7]。近年研究发现，MEG3在胰腺癌中可发挥抑癌基因作用，敲除MEG3可使胰腺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力明显增强，并发现MEG3低表达的胰腺癌患者预后较差[8]。Zheng等[9]研究表明，MEG3过表达可抑制肝癌细胞增殖。此外，MEG3低表达还可增加60岁以下人群罹患结直肠癌的风险[10]。目前认为，MEG3可能是通过调节miR-21或p53信号通路，抑制肿瘤血管生成，从而阻止肿瘤恶性进展[11，12]。GAS5为近年发现的、具有肿瘤抑制功能的lncRNA，属GAS家族成员，位于人类1号染色体长臂2区5带，全长4 087 bp，由12个外显子组成。在人体肝、肾和血管等组织中均能检测到GAS5表达。在卵巢癌、肝细胞癌等组织中GAS5低表达，其低表达可促进肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移[13，14]。Liu等[15]研究发现，在结直肠癌组织或患者血液中GAS5表达均明显降低，并且GAS5低表达的结直肠癌细胞增殖和迁移能力明显增强。有研究证实，在胃癌组织或细胞中GAS5表达受到抑制，并且GAS5低表达还能降低肿瘤细胞对阿霉素的敏感性，进一步研究发现，其作用机制可能与抑制ERK信号通路激活有关[16]。Guo等[17]研究认为，GAS5对胃癌细胞的抑制作用可能是通过调控p21、CDK6蛋白表达，将肿瘤细胞阻滞于G1/S期，从而抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡。虽然已有研究证实，MEG3、GAS5低表达与肝癌、乳腺癌和胰腺癌等肿瘤进展和患者预后不良有关，但二者表达变化与胃癌进展和患者预后的关系目前报道较少。

本研究结果显示，胃癌组织MEG3、GAS5表达均明显低于癌旁正常组织，提示MEG3、GAS5可能在胃癌的发生、发展中具有抑癌基因作用。本研究结果还发现，胃癌组织MEG3、GAS5表达与肿瘤组织分化程度、临床分期和淋巴结转移有关，与患者性别、年龄、肿瘤直径无关，提示MEG3、GAS5低表达与胃癌进展有关。本研究结果还发现，MEG3、GAS5低表达者中位生存时间较MEG3、GAS5高表达者均明显缩短，其术后3年生存率亦明显低于MEG3、GAS5高表达者，表明MEG3、GAS5低表达的胃癌患者术后生存时间更短，预后更差。

综上所述，胃癌组织MEG3、GAS5低表达，其低表达与胃癌进展和患者预后不良有关。但由于本研究样本量较小，其结论准确性尚需大样本量、多中心研究进一步验证。