生物传导芯片在食品安全检测中的应用进展

杨帆*，王苏仪，刘晓飞，崔琳琳，MARCHISIO Mario

1. 黑龙江省第二医院，暨黑龙江省中毒抢救治疗中心，黑龙江省劳动卫生职业病研究院（哈尔滨 150000）；2. 哈尔滨商业大学食品工程学院（哈尔滨 150000）；3. 哈尔滨工业大学生命科学与技术学院（哈尔滨 150000）

食品安全是一个与人们健康息息相关的重大问题，许多导致人类疾病的高风险因素是通过食品传播的。近年来，食品成分中含有害有毒物质，如杀虫剂[1]、盐酸克伦特罗[2]、兽药[3]、生物毒素[4]等，已引起许多食品安全事故，而对于复合污染物、过敏原、病原体、添加剂等的检测分析和制作过程控制，对维护人们健康同样具有重大意义[5]。加强食品安全监管已成为各级政府的重要而紧迫的任务之一，但是检测食品中的有害有毒物质存在许多困难，例如复杂基质样品，需要测试的有害有毒物质的各种类型和复杂成分，以及测试低含量的化合物等。利用气相色谱和高效液相色谱等传统测试仪器价格昂贵，样品处理步骤复杂，检测周期长，检测成本高，难以满足现场快速测量的要求，也不能用于有毒有害物质的早期监测。因此，食品工业需要适当的分析方法及技术手段来检查食品的安全性和质量[6]。

生物传感芯片是20世纪90年代在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术。生物芯片的主要特点是高通量、微型化和自动化，能在短时间内对生物样品进行分析，快速准确地获取样品中大量的生物信息，其效率是传统检测手段的成百上千倍[7]。而生物传感芯片技术的原理，在于其采用原位合成或微矩阵点样等方法，将大量生物大分子如核酸片段、多肽片段（甚至组织切片）、细胞等样品有序地固定在硅胶片或聚丙烯酰胺凝胶等支持物表面，组成密集的二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中的靶分子杂交，通过特定的仪器（如激光共聚焦扫描）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效的检测分析，判断样品中靶分子的数量，从而达到分析检测的目的[8]。

具体论述已经开发的几种不同类型的生物传感芯片，包括用于检测食品中有毒有害物质的基于免疫测定和PCR的生物传感芯片，及表面等离子体共振传感芯片等，总结其各自的分析性能，包括检测的限制条件和分析时间。

1 生物传感芯片

1.1 侧流测定（LFA）

侧向流动测定（LFA）是一种极简单的免疫测定形式，其在诊断市场上获得极大的普及，源于LFA最著名的妊娠试验。使用者将一滴尿液样品施加到盒式装置上或将条带浸入尿液样品中。如果出现两条粉红色的线条，怀孕；一条粉红色的线，没有怀孕；没线，测试失败。LFA本质上是预装有几种不同抗体的膜。这被认为是最简单的生物传感芯片形式之一，LFA当然可以用于检测食品中有毒有害物质的检测。

硝酸纤维素膜是LFA中最常用的材料，这种膜的孔径在0.05～12 μm之间变化，这决定了液体转运的速度和试验的灵敏度。当样品具有高黏度或含有脂肪球（例如牛奶）时，膜的材料选择和孔径特别重要[9]。核酸LFA利用一对引物（即对病原体核酸特异的核酸的短序列）代替抗体，并检测样品中这种核酸序列的存在。由于样品中此类核酸的量可能非常低，因此通常需要PCR扩增。Kong等[10]通过LFA检测能量饮料和牛奶中叶酸的含量，Liu等[11]则采用LFA方法快速地检测出食品中的相思豆毒素的含量。但是该方法由于PCR的扩增要求，核酸LFA并不适合外出应用[12]。

LFA非常易于使用，且价格低廉。它可以在室温下储存，是一次性的，因此没有交叉污染问题。目前已报道的检测限为10 ng/mL，用于蚊子血粉中的IgG[13]、血吸虫的0.2 ng/mL尿液[14]、鱼精子中肺炎链球菌1 ng/mL[15]、血清中梅毒螺旋体5 ng/mL[16]。

1.2 ELISA 生物传感芯片

ELISA通常在微板上进行，并且用酶标仪对其结果进行定量。在某种程度上，这是一种光学免疫传感器。这种方法可以使用微通道替换孔，其中目标溶液连续地流过微通道（流动注射分析），将抗体固定在微通道的特定位置的内表面上，这种连续流动的特性使漂洗非常有效。实际上，该方法既不需要抽吸-分配循环又不需要搅拌，因为流动应该从微通道的内表面除去任何过量的分子，将光照射到固定抗体的位置，而光传感器从微通道的另一侧读取信号。

最近，已经证明了使用ELISA型实验室芯片检测食源性病原体的许多新型检测方案，其拥有近乎实时且具有优异的灵敏度。Guan等[17]证明大肠杆菌O157：H7（使用抗大肠杆菌）的生物发光检测，检测限为3.2×101CFU/mL，测定时间为20 min。Wojciechowski等[18]使用抗体包被的有机光电二极管检测葡萄球菌肠毒素B，检测限为0.5 ng/mL。除此以外，Dong等[19]则通过ELISA生物传感芯片在牛肉中成功检测出口蹄疫病毒，其采用镍螯合化学方法将重组蛋白（抗原）固定在聚苯乙烯微球上，测定牛血清中FMDV抗体。结果表明，在25 min的检测时间内，仅用10 mU/L样品量就能成功地检测出口蹄疫病毒。最大阳性百分率（NPPV）为303%，稀释倍数为32倍，评价分析灵敏度。该方法的批内变异系数（CV）值分别为15.5%和17.1%，完全符合世界动物卫生组织（OIE）传染病诊断试验验证原则。ELISA生物传感芯片还被应用在检测食物中黄曲霉素[20]，Sciancalepore等[21]则在30 min内对150 nL的起始样品，检测出15个食源性细菌细胞。

1.3 基于聚合酶链反应（PCR）的生物传感芯片

自20世纪80年代中期以来，PCR技术已被证明是检测食品中病原体的宝贵方法，并发表了许多关于不同食源性病原体的PCR检测的论文，包括大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、金黄色葡萄球菌等。实时PCR是用于定量特定DNA片段的最常用技术。通过检测由于特异性扩增产生的荧光信号，实时测量PCR过程中合成的产物量。实时PCR需要特殊的热循环仪和通常特定的荧光探针。

目前已有的微PCR芯片可分为三种：第一种是固定室微PCR芯片作为传统热循环的纳米/微微升储库；第二种是连续流微PCR芯片，其中在不同的温度区域内建立不同位置，使样品可以在各个温度的各个区域之间移动，以此进行循环；第三种是基于液滴的PCR系统，其中扩增反应在每个扩增子的油包水滴中进行[22]。

Chin等[23]用天然污染的猪肉样品进行多重直接PCR检测沙门氏菌的敏感性和特异性。以常规细菌培养方法为参考，评价多重直接PCR的效果。其相对准确度、灵敏度和特异性分别为98.8%，97.6%和100%。Bai等[5]发现了一种用于检测食源性病原体的光学薄膜生物传导芯片的方法。主要原理是将醛标记的探针排列并共价连接到肼衍生的芯片表面上，然后将生物素化的聚合酶链式反应（PCR）扩增子与探针杂交，再用抗生素免疫球蛋白G-辣根过氧化物酶结合物和可沉淀的辣根过氧化物酶底物洗涤和短暂温育后，将与探针结合的生物素化链可视化为芯片表面上的颜色变化（金色至蓝色/紫色）。PCR片段靶标的高灵敏度和准确检测可在30 min内完成。该测定非常稳健，灵敏，特异且经济，并且可以适应不同的通量。但有时显示假阳性和假阴性结果，需要进一步确认，如探针杂交和限制性片段长度多态性问题等。

1.4 表面等离子体共振传感芯片

基于表面等离子体共振（Surfaceplasmon resonance，SPR）的SPR传感芯片的基本原理是：将某种单链DNA分子结合在金属膜表面，加入与其互补的单链DNA，两者的结合将使金属膜与溶液界面的折射率上升，从而导致共振角度改变。如果固定入射光角度，就能根据共振角的改变程度对互补的单链DNA进行定量。这一原理可用于分子杂交的快速检测。与纳米技术等先进技术的联合应用，SPR技术被广泛用来研究生物分子，如蛋白质-蛋白质、药物-蛋白质、核酸-蛋白质、核酸-核酸之间相互作用的反应动力学、结合位点和反应物浓度等信息，其优越性是常规分析技术所无法比拟的[24]。

LFA和ELISA两种生物传感芯片都需要具有标签的二抗，例如金纳米颗粒、荧光染料和化学发光染料，随后进行多次漂洗步骤。目前有几种不涉及标记的替代方法，如无标记免疫测定生物芯片。基于不同的信号转换机制，无标记型生物传感器又分为SPR、石英晶体微量天平（QCMs）和微悬臂梁等[25]，其中SPR可能是最受欢迎的无标记免疫分析生物传感芯片之一。

在SPR在食品有毒有害物质检测中应用的先期报道中，Li等[26]通过一种便携式基于免疫抑制原理的高灵敏和可重复利用的SPR免疫传感器，检测出香豆素和盐酸克仑特罗的抗体-抗原免疫应答，并通过竞争性和连续检测方法检测了香豆素分子，印证该方法可以通过减少实验步骤、延长服务时间、增长生物传感芯片寿命和降低测试成本，来快速实现大量样品现场检测。Hana等[27]则在复杂的汉堡包和黄瓜样品中发现，基于厚度低至20 nm的pCBAA刷的SPR生物传感器能够检测大肠杆菌O157：H7和沙门氏菌，两种细菌的检测限分别为57 CFU/mL和大肠杆菌17 CFU/mL，沙门氏菌分别为7.4×103和11.7×103CFU/mL，具有非凡的灵敏度和特异性。

1.5 乳胶免疫凝集试验（LIA）芯片

另一种更简单的免疫测定形式可以在芯片实验中重复显示，称为乳胶免疫凝集测定（LIA）。虽然这不是无标签，但它可能是无冲洗的（ELISA和SPR实验室芯片都需要冲洗步骤）。在LIA中，颗粒用针对给定靶标的抗体包被并与所讨论的样品液体混合。如果抗体存在于流体中，则颗粒会形成更大的聚集体，这种抗体-抗原相互作用称为免疫凝集。过去已在视觉上被观察到，检测极限是凝集物沉淀并变得可见的点，但在芯片实验中通过前向光散射测量免疫凝集更为合适，因为凝集的亚微米或纳米颗粒不需要从溶液中沉淀出来以获得正信号[28]。Heinze等[29]在1%稀释的鸡粪中检测到禽流感病毒，检出限为10 pg/mL。You等[30]检测到10%稀释的莴苣中检测限为10 CFU/mL的大肠杆菌。Fronczek等[31]在10%稀释的鸡肉组织中检测到沙门氏菌，检测限为10 CFU/mL，所有检测时间均为10 min或更短。

但是，LIA并不总能提供完美的结果。特异性始终是一个问题，因为非特异性结合可能导致假阳性读数。为了抑制非特异性结合，在颗粒悬浮液中加入了表面活性剂，而表面活性剂有时即使在存在靶抗原时也会阻止颗粒凝集（假阴性）。为了解决这个问题，高羧化胶乳颗粒（即表面被羧基侧链饱和）可用于LIA实验室芯片，因为高度羧化的胶乳颗粒能够在不使用表面活性剂的情况下提高颗粒稳定性，在微流体混合中具有优势[32]。

1.6 具有电化学检测的免疫分析实验室芯片

1.6.1 阻抗免疫分析芯片

该芯片利用电化学而非光学检测，是将抗体固定在表面上，其中两个电极称为交叉指型微电极（IME）的构型图案化。当像细菌这样的大靶标与表面结合的抗体结合时，一些靶标能够桥接两个电极，从而降低电阻。如果电极图案非常小（微电极），那么可以检测到较小的靶，例如病毒和蛋白质。IME免疫传感器已经成功地用于检测许多不同食物样品基质中的病原体，包括Guo等[33]使用电化学阻抗谱检测大肠杆菌，检测限为102CFU/mL。

1.6.2 碳纳米管（CNT）免疫分析芯片

CNT在电化学免疫测定中的主要优点是增强的电子性质，大的边缘平面/基面比和快速的电极动力学。因此，基于CNT的免疫测定通常具有比传统碳电极更高的灵敏度、更低的检测限和更快的电子转移动力学。CNT的优异机械和导电性能（高致动应力、低驱动电压和高能量密度）使它们非常有希望开发用于疾病诊断的超灵敏和小型化免疫传感器。Li等[34]通过结合CNT多层生物传感器和基于微流控芯片的环介导等温扩增（LAMP），对大肠杆菌O157：H7及其毒性基因进行视觉和即时检测，功能化的CNT多层生物传感器可以选择性地捕获复杂样品中的目标细菌大肠杆菌O157：H7。随后用基于微流体芯片的LAMP分析释放的细菌的DNA浓度，在系统优化捕获和检测条件后，传感平台能够检测低至1 CFU/mL的浓度而无需复杂仪器，这比以前报道的方法灵敏得多。

1.7 光纤或光波导入生物传感芯片中的使用

生物传感芯片的一个传统缺点是它们的高检测限（因此灵敏度差），这是因为小体积减少了可检测信号。而通过使用光学检测，将光纤与芯片实验室微流体装置集成，可以获得更低的检测限（在单分子水平上），以提高灵敏度。通常光纤用于从其光源传输光，而另一组光纤用于检测生物反应，但只有在相对干净的环境中才能使用光学方法检测。此外，样品体积必须足以维持如此低的检测限。

通常，在传导芯片中使用的光纤分为嵌入式光纤、接近光纤两类纤维取向。嵌入式光纤实际上包含在传感芯片中，与微通道结构物理接触，这使其发挥了最佳性能，信号损失微不足道，但是它需要极其复杂的制造工艺。此外，接近光纤位于芯片附近但不接触芯片。因此，它们易于开发，尽管它们可能在其信号中引入额外的噪声。

2006年，Rindorf等[35]首次将微结构光纤（MOF）嵌入到生物芯片中应用。一个16 mm长的MOF被整合到光学流体耦合器芯片中，该芯片是使用CO2激光器在PMMA聚合物中制造的。开发的芯片配置允许通过MOF的液体流量和瞬时的光学特性产生连续控制。当MOF集成在芯片中时，MOF通过将传感层固定在光纤的微结构化内，而表面上功能化，以捕获特定的单链DNA串。传感层含有与靶DNA序列互补的DNA链，通过高选择性DNA杂交过程进行操作。这是一种使用消逝波传感原理进行捕获DNA的光学检测。由于芯片尺寸小，所提出的技术允许分析低至300 nL的样品体积以及制造小型化便携式设备。Han等[36]则使用接近光纤（即纤维紧密接触但不接触微流体装置）来量化备检物，由于微流体装置中乳胶免疫凝集引起光散射增加，该检测限低于（优选在单细胞水平上）其他传统方法，他们实验证明了大肠杆菌的实时检测，且该方法基本上是一步法，并且不需要样品预处理或细胞培养。检测限低至每个装置40 CFU/mL或每台设备4 CFU（仅限活细胞），或每个装置＜10 CFU/mL或每台设备＜1 CFU（包括死细胞和游离抗原），该结果优于在微流体装置中进行的大肠杆菌检测的其他结果。该技术非常适于应用，因为它允许光源和检测器在非常靠近芯片的检测区域处的精确定位，这消除了对更大和昂贵的光学定位阶段的需要。

2 结语与展望

近几年，食品安全在我国已成为严重的公共卫生问题，食品的安全性成为消费者、政府监管机构的重要关注对象。生物芯片作为新兴的生物技术，具有高效、大信息量和高特异性的特点，能够在很短时间内分析大量的生物分子，使人们能快速准确地获取样品中的靶信息，检测效率比传统检测手段有了极大的提高。目前，随着科研的不断深入，纳米技术和半导体技术已经开始助力生物芯片的发展，这使得生物传导芯片可以微小化、精密化。而在此基础上，接下来的发展方向还要集中在如何不断提升生物传导芯片的实际检测效率，使其快速又真实可靠地产生结果。在生物传导芯片的研发过程中，应该不断加强、不断健全与芯片配套的分析系统，形成高度的集成化。随着食品安全问题日益突出，食品检测项目不断复杂化，生物传导芯片不仅要满足快速、稳定、可视的基本要求，还应不断增大芯片的信息容纳能力，具备同时检测多种项目的能力[37-40]。如此可见，生物传导芯片虽然拥有广阔的发展市场和应用前景，但研究还需不断深入，任重道远。