吴建国,林柳悦,吴岩斌,吴锦忠
(福建中医药大学药学院,福建 福州 350122)
铁皮石斛(Dendrobium officinaleKimura et Migo)为兰科石斛属植物,俗称铁皮枫斗,是常用的名贵中药,《神农本草经》中列为上品,功能益胃生津,滋阴清热,用于热病津伤,口干烦躁,胃阴不足,食少干呕,病后虚热不退,阴虚火旺,骨蒸劳热,目暗不明,筋骨痿软[1]265。 铁皮石斛含有黄酮、多糖、甘露糖、和生物碱等活性成分,具有抗衰老、抗氧化和免疫调节等作用[2-4]。本实验对5种不同种质来源铁皮石斛茎含水量、总黄酮和多糖含量进行测定,为其质量评价提供参考依据。
1.1 材料与试剂 5种不同种质来源铁皮石斛来自福建连城(LC)、浙江(ZJ)、厦门集美(JM)、厦门(XM)和云南(YN),福清市佳家农业综合发展有限公司提供,经黄泽豪副教授鉴定为兰科石斛属铁皮石斛(Dendrobium officinaleKimura et Migo)。芦丁对照品(中国药品生物制品检定所,批号:100080-200707);葡萄糖标准品(上海国药集团有限公司,分析纯);无水乙醇(天津市致远化学试剂厂,分析纯);氢氧化钠、苯酚(天津福晨化学试剂厂);硝酸铝(上海新宝精细化工厂);亚硝酸钠、浓硫酸(上海三鹰化学试剂有限公司,分析纯)。
1.2 仪器 AR223CN千分一电子天平(上海奥豪斯仪器有限公司);UV-1800紫外可见分光光度计(日本岛津公司);KQ-500E超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司);石英比色皿(上海精密科学仪器有限公司);SFG-0.2600电热恒温鼓风干燥箱(黄石市恒丰医疗器械有限公司);RE-2000A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);SHB-Ш循环水式多用真空泵、DLSB-5/20低温冷却液循环泵、R501C恒温水浴锅(郑州长城科技工贸有限公司)。
2.1 新鲜铁皮石斛茎含水量测定 采用2010年版《中国药典》一部,附录 IX H 水分测定法[1]147,结果见表1。
表1 5种不同种质来源铁皮石斛茎含水量测定结果
2.2 铁皮石斛茎总黄酮含量测定
2.2.1 供试品溶液的制备 将铁皮石斛茎用蒸馏水洗净、干燥、粉碎,准确称取1.0 g铁皮石斛干燥粉末,加入料液比1∶30,80%的乙醇回流提取3次,2 h/次,合并滤液并浓缩,回收溶剂后用80%乙醇定容于50 mL量瓶中。
2.2.2 芦丁标准曲线制定 精密称取芦丁对照品10 mg,置于50 mL瓶中,无水乙醇定容至刻度,得浓度为0.2 mg/mL的对照品;依次精密量取芦丁对照品溶液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 和 3.0 mL 于 10 mL的量瓶中,分别加入蒸馏水至3 mL;依次分别加入5%亚硝酸钠溶液0.5 mL混匀,放置6 min,加10%硝酸铝溶液0.5 mL摇匀,放置6 min,再加入4%氢氧化纳溶液5 mL,加蒸馏水稀释至刻度摇匀,放置15 min;以相应的试剂为空白对照,在510 nm处测得吸光度值[5]。结果表明芦丁在 0.01~0.06 mg/mL线性关系良好,标准曲线的回归方程为:
2.2.3 总黄酮含量测定方法学验证 精确吸取芦丁对照品溶液2 mL于10 mL的量瓶中,共6份,按“2.2.2”方法连续测量6次,计算其吸光度RSD为0.43%,表明仪器精密度良好。稳定性试验精确量取3号供试品溶液2 mL于10 mL的量瓶中,共6份,按“2.2.2”方法每隔10 min测量,结果显示平均吸光度值为0.210,RSD值为1.18%,表明待测品溶液在50 min内稳定性良好。取3号供试品6份平行制备供试品溶液,按“2.2.2”项连续测量,结果显示平均含量为0.442%,RSD值为1.50%,表明重复性良好。精密称取6份已知总黄酮含量的3号铁皮石斛粉末1.0000 g,加入一定量的芦丁对照品,按照2.2.1所述制得样品液,按照2.2.2所述显色并测定吸光度,得平均回收率为99.46%,RSD值为1.02%。
2.2.4 供试品中总黄酮含量测定 精密吸取2 mL供试品溶液,按“2.2.2”方法测定吸光度,每个供试品按照该法平行测定3份,取其平均值,计算铁皮石斛中总黄酮的含量。见表2。
表2 5种不同种质来源铁皮石斛茎中总黄酮含量
2.3 铁皮石斛茎多糖含量测定
2.3.1 供试品溶液的制备 精密称定铁皮石斛粉末(过 3号筛)约 0.3 g,平行 3份,加水 200 mL,加热回流2 h,趁热过滤,定容;精密量取续滤液2 mL,置15 mL离心管中,精密加入无水乙醇至10 mL,摇匀,冷藏1 h后离心,弃去上清液,沉淀加80%乙醇洗涤2次,每次8 mL,离心,弃去上清液,干燥得石斛多糖;加热水溶解,转移至25 mL量瓶中,放冷,加水至刻度,摇匀,备用。
2.3.2 葡萄糖标准曲线制定 精密称取葡萄糖标准品5 mg,置于50 mL的量瓶中,蒸馏水溶解定容至刻度,得浓度为0.1 mg/mL的对照品;分别精密量取葡萄糖标准品溶 液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL置于10 mL的具塞试管中,并分别加蒸馏水至2 mL,各加1.0 mL 5%苯酚溶液,振摇混匀,迅速加入浓硫酸5.0 mL,混合均匀,于沸水浴中加热15 min,取出,迅速冷却至室温,以相应的试剂为空白对照。在490 nm处测得吸光度值[6],结果表明葡萄糖在2.655~15.930 mg/L线性关系良好,标准曲线的回归方程为:
2.3.3 多糖含量测定方法学验证 精确吸取葡萄糖对照品溶液2 mL于10 mL的量瓶中,共6份,按“2.3.2”方法连续测量6次,计算其吸光度RSD为0.43%,表明仪器精密度良好。稳定性试验精确量取3号供试品溶液2 mL于10 mL的具塞试管中,共6份,按“2.3.2”方法每隔10 min测量,结果显示平均吸光度值为0.319,RSD值为1.20%,表明待测品溶液在1 h内稳定。取3号供试品6份平行制备供试品溶液,按“2.3.2”项连续测量,结果显示平均含量为29.1%,RSD值为0.65%,表明重复性良好。准确称取6份已知总多糖含量的3号石斛多糖,准确加入一定量的葡萄糖对照品,按照2.3.1所述制得样品液,按照2.3.2所述显色并测定吸光度,得平均回收率为98.39%,RSD值为1.58%。
2.3.4 供试品中多糖含量测定 精密吸取2 mL供试品溶液,按“2.3.2”项测量,每个供试品按照该法平行测定3份,取其平均值。测得的吸光度代入回归方程中,计算铁皮石斛中多糖的含量。见表3。
表3 5种不同种质来源铁皮石斛茎中多糖含量
本实验结果发现:5种不同来源铁皮石斛茎不论是含水量,总黄酮和多糖含量均存在一定的差异,含水量以云南种质来源最高(云南>厦门>连城>厦门集美>浙江>70%);总黄酮含量也以云南最高 (云南>浙江>厦门集美>厦门>连城>0.4%);而多糖含量则以浙江最高(浙江>厦门>福建连城>云南>厦门集美)。这些差异可能来自于不同的种质来源。本实验为石斛的质量评价及控制提供了一定的参考依据,不同种质来源石斛的质量差异及其影响因素有待于进一步的研究。