豆茶决明冲剂对高脂饮食诱导的肥胖C57BL/6J小鼠的相关炎症因子及炎症通路的影响

关云霞 张秋华 王丹 付彦君 王卉

[摘要] 目的 探討豆茶决明冲剂对高脂诱导C57BL/6J肥胖小鼠炎症因子及炎症通路的影响及对高脂所致肥胖胰岛素抵抗的改善作用。 方法 C57BL/6J小鼠90只适应性喂养2周后，随机预留对照组，其余小鼠高脂饲料喂养2周，随机分成模型组、豆茶决明冲剂低、中、高剂量组（LD、MD、HD;0.1、0.3、0.9 g/kg）、罗格列酮组（RH）。除对照组外，其余5组给予高脂饲料，每周称体重。每天灌胃1次，给药8周后，摘眼球取血，测空腹血糖、胰岛素和血脂，取腹部、附睾及双肾部位脂肪。采用ELISA法检测相关炎症因子，采用蛋白质免疫印迹法（Western Blot）检测IKK-β/NFκB、JNK通路蛋白的表达。 结果 豆茶决明冲剂能显著抑制高脂诱导C57BL/6J小鼠体重的增长。豆茶决明冲剂能降低空腹血糖（FPG）、空腹胰岛素（INS），改善胰岛素抵抗指数（IRI）;试剂盒实验结果显示豆茶决明冲剂能使LDL-C、TC、TG显著降低，HDL-C明显升高。ELISA结果显示豆茶决明冲剂能显著降低瘦素（leptin，LEP）、白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）水平，升高脂联素（ADPN）水平;Western Blot结果显示，豆茶决明冲剂高剂量组对激活的IKK-β/NFκB、JNK通路有明显的抑制作用。 结论 豆茶决明冲剂能抑制由高脂饮食诱导的肥胖以及相关炎症因子的分泌和炎症通路的激活，改善胰岛素抵抗。

[关键词] 豆茶决明冲剂;肥胖;炎症因子;炎症通路;胰岛素抵抗

[中图分类号] R285.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）07-0033-06

[Abstract] Objective To discuss the effects of cassia nomame granules on inflammatory factors and inflammatory pathways in obese C57BL/6J mice induced by high fat diet and its effect on the improvement of obesity insulin resistance. Methods Ninety C57BL/6J mice were selected for adaptive feeding for 2 weeks. The control group was randomly reserved. The other mice were fed with high fat diet for 2 weeks， and were randomly divided into model group， cassia nomame granules low-dose group， medium-dose group and high-dose group（LD， MD， HD; 0.1， 0.3， 0.9 g/kg）， and rosiglitazone group（RH）. Except the control group， the other 5 groups were given high fat diet and weighed weekly. The drugs were administered once a day by intragastric administration. After 8 weeks， blood was sampled from the eyeballs to measure fasting blood glucose， insulin and blood lipids， and fat in the abdomen， epididymis and kidneys were taken. The inflammatory factors were detected by ELISA， and the expression of IKK-β/NFκB and JNK pathway proteins was detected by Western Blot. Results The cassia nomame granules significantly inhibited the growth of C57BL/6J mice induced by high-fat diet， and it could reduce fasting blood glucose（FPG）， fasting insulin（INS）， and improve insulin resistance index（IRI）. The experimental results of the kit showed that the granules significantly reduced LDL-C， TC， and TG， and significantly increased HDL-C. ELISA results showed that the granules significantly reduced leptin（LEP）， interleukin-6（IL-6）， tumor necrosis factor-α（TNF-α）， and monocyte chemoattractant protein-1（MCP-1） levels， and increased the level of adiponectin（ADPN）. The results of Western Blot showed that the high dose of the granules had a significant inhibitory effect on the activated IKK-β/NFκB and JNK pathways. Conclusion The cassia nomame granules can inhibit the obesity induced by high-fat diet and the secretion of related inflammatory factors and the activation of inflammatory pathways， and improve insulin resistance.

[Key words] Cassia nomame granules; Obesity; Inflammatory factor; Inflammatory pathway; Insulin resistance

随着生活水平的提高，我国肥胖人群数量迅猛增长。有研究表明，超过80% 的2型糖尿病患者同时受到肥胖的困扰，显示出肥胖与2型糖尿病的相关关系[1]。肥胖引发的慢性炎症能导致胰岛素抵抗（IR），而长期IR最终导致糖尿病的发生。目前，IR发生的炎症反应学说得到医学界普遍接受。很多研究认为，肥胖时脂肪细胞分泌的多种炎症因子，如白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等均可引起或参与炎症反应。肥胖尤其是内脏型肥胖者脂肪细胞增生、肥大可促进分泌促炎或炎症因子。因此，科学家提出“肥胖是一种低度的炎症状态”[2，3]。豆茶决明[Cassia mimosoides（Sieb.）Kitag]是豆科决明属植物，是民间常用的药食两用植物，在辽宁省广泛分布。课题组前期研究证明，豆茶决明水煎液具有抗肥胖、调节血脂和改善IR等作用[4]，豆茶决明冲剂含药血清对3T3-L1 前脂肪细胞分化有抑制作用，其分子机制可能与下调PPARγ、C/EBPα 和C/EBPβ mRNA 和蛋白表达相关[5]。基于以上研究，本文旨在研究豆茶决明冲剂对饮食诱导的肥胖的防治及其对炎症因子和炎症通路的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物  健康雄性C57BL/6J小鼠90只，体重20～24 g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，动物合格证号 SCXK（京）2014-0004。

1.1.2 药物  豆茶决明全草：采摘于辽宁省宽甸，经辽宁省食品药品检验所王维宁教授鉴定为豆茶决明[Cassia mimosoides（Sieb.）Kitag]干燥全草。豆茶决明冲剂制备：同本课题组前期实验方法[5]，称取豆茶决明干燥全草107 g，粉碎，加10倍量80%乙醇，加热回流提取2次，每次1 h，过滤后合并滤液，减压浓缩、干燥得初提物。初提物粉碎，过80目筛，加蔗糖3份糊精1.25份，85%乙醇做润湿剂，18目筛整粒，60℃减压真空干燥，105℃远红外灭菌，即得。

1.1.3 豆茶决明冲剂、阳性药和高脂饲料的配制  将86 g豆茶决明冲剂溶于672 mL蒸馏水，充分溶解为豆茶决明冲剂高剂量组，再分别稀释3、9倍作为豆茶决明冲剂中、低剂量组。罗格列酮片（成都恒瑞制药有限公司，批号H20030569）1片4 mg溶于106.7 mL水中，充分溶解，作为阳性药组。高脂饲料配比同本课题组前期实验方法[4]：普通飼料77%，蔗糖10%，熟猪油10%，胆固醇2%，胆酸盐1%，由北京科奥协力有限公司制作。

1.1.4 试剂及设备  瘦素（leptin，LEP）、脂联素（ADPN）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素6（IL-6）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）ELISA检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，批号分别为：ml002287、ml057809、ml002095、ml002293、ml037840）;低密度脂蛋白（LDL-C）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）测试盒（南京建成生物工程研究所，批号均为：20170907）;JNK、IKKβ、NFκB单克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号：bs-2592R、bs-7557R、bs-23217R）;P-JNK、P-IKKβ单克隆抗体（Signalway Antibody，USA，批号：11504-1、11931-1）;HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（EARTHOX，USA，批号：E030120）;β-actin（北京博奥森生物技术有限公司，批号：bs-0061R）;蛋白marker（赛默飞世尔科技有限公司，批号：26617）;SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X）（碧云天生物技术有限公司，批号：P0015）;Western及IP裂解液（碧云天生物技术有限公司，批号：P0013）;ECL发光液（碧云天生物技术有限公司，批号：P0018）;一、二抗稀释液（碧云天生物技术有限公司，批号：P0023A、P0023D）;BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术有限公司批号：P0012S）;SDS-PAGE凝胶试剂盒（碧云天生物技术有限公司，批号：P0012A）;蛋白酶抑制剂混合物（北京索莱宝科技有限公司，批号：A8260）;PVDF膜（北京智杰方远科技有限公司，批号：IPVH00010）。电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司，型号：98-1-B）;旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂，型号：RE-3000）;循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司，型号：SHB-ⅢA），电热鼓风干燥（上海精宏实验设备有限公司，型号9423A）;多功能酶标仪（奥地利TECIN，型号：INFINITE M200）;垂直电泳槽（上海天能科技有限公司，VE680微型）;全自动化学发光图像分析系统（公司上海天能科技有限公司，型号：Tanon-5200）;ESP600电泳仪（上海天能科技有限公司，型号：ESP 600）。

1.2研究方法

C57BL/6J雄性小鼠适应性喂养2周后，随机预留对照组15只小鼠，其余小鼠高脂饲料喂养2周，2周后随机分为5组，即模型组、阳性药罗格列酮组（RH）、豆茶决明冲剂高、中、低剂量组（HD、MD、LD），对照组给予普通饲料，其他5组给予高脂饲料喂养，每天按0.02 mL/g灌胃给药1次，HD、MD、LD组给予0.9、0.3、0.1 g/kg三个剂量，RH组按0.75 mg/kg灌胃给予罗格列酮，对照组与模型组灌胃给予饮用水，连续给药8周。

1.3观察指标

（1）一般情况观察：每天观察小鼠毛色、状态、饮食及尿液粪便。（2）体重、空腹血糖及脂肪重量。给药后，每周称体重，第8周末，禁食不禁水12 h，测量空腹血糖，摘眼球取血。处死小鼠，取小鼠腹部、附睾以及双肾部位的脂肪，用滤纸吸取表面液体，用电子天平分别称重，-80℃冷藏备用。（3）血清FBG、INS和血脂HDL-C、LDL-C、TC、TG的浓度：按照试剂盒说明检测。（4）血中瘦素、脂联素、TNF-α、IL-6、MCP-1的含量：酶联免疫法试剂盒检测。（5）计算胰岛素抵抗指数：IRI=（空腹胰岛素浓度×空腹血糖浓度）/22.5。（6）脂肪组织中p-IKKβ/IKKβ、p-JNK/JNK、NFκB的變化：蛋白质免疫印迹法（Western Blot）检测，取腹部脂肪组织100 mg放入液氮研磨，加500 μL裂解液与磷酸酶抑制剂混合液（100：1）充分裂解，4℃、12000转/min、离心10 min，重复离心直到上清液清澈，提取上清。BCA试剂盒检测样品蛋白浓度。蛋白质样品加上样缓冲液95℃变性5 min，用10% SDS-PAGE凝胶，90 V分离蛋白，400 mA转膜40 min。转膜后Western封闭液封闭30 min。一抗4℃孵育过夜，二抗孵育2 h，曝光显影检测蛋白质。

1.4 统计学分析

采用SPSS19.0软件对数据进行处理与分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两两比较采用LSD-t检验及Dunnett-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠生长状况比较

对小鼠的皮毛、状态观察发现，对照组和豆茶决明组小鼠皮毛光亮、饮食状态良好、无腹泻情况产生。与对照组相比，模型组体重明显升高，给药第8周末实验结束时二者有显著性差异（P<0.01）。与模型组相比，HD、RH组抑制效果最为明显（P<0.01），MD组也有所下降（P<0.05）。LD组无明显变化（P>0.05）。实验结果表明，豆茶决明冲剂可以减轻高脂诱导的小鼠体重的增加（表1）。

2.2各组小鼠脂肪重量比较

由表2可知，与对照组相比，模型组双肾、腹部及附睾脂肪重量明显增加。与模型组相比，MD、HD、RH组腹部脂肪、双肾及附睾脂肪重量明显降低（P<0.01，P<0.05）。LD组可使腹部脂肪降低（P<0.01），但是对双肾及附睾脂肪重量无明显影响（P>0.05）。结果表明，豆茶决明冲剂可以抑制高脂诱导的小鼠体内脂肪的增加（表2）。

2.3 各组小鼠空腹血糖（FPG）、胰岛素（INS）和胰岛素抵抗指数（IRI）比较

从表3可以看出，与对照组比较，模型组小鼠的空腹血糖（FPG）、胰岛素（INS）以及胰岛素抵抗指数（IRI）明显升高;与模型组比较，LD、MD、HD组、RH组的FPG、INS和IRI明显下降。表明豆茶决明冲剂可以显著降低高脂饮食小鼠的FPG、INS和IRI。

2.4 各组小鼠血脂比较

经过高脂饲料喂养后，与对照组相比，模型组LDL-C、TC、TG明显升高（P<0.01），HDL-C明显降低（P<0.01）;与模型组相比，MD、HD、RH组LDL-C、TC、TG均降低， HDL-C水平升高。LD组HDL-C水平升高，LDL-C降低。结果表明，豆茶决明冲剂对血脂具有调节作用，随着剂量的增加，作用越明显（表4）。

2.5各组小鼠相关炎症因子比较

与对照组相比，模型组经高脂饲料喂养后，肿瘤坏死因子α（TNF-α）、血清中瘦素（leptin， LEP）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、白介素-6（IL-6）含量明显增加（P<0.01），而脂联素（ADPN）水平显著降低。与模型组相比，MD、HD、RH组能使LEP、IL-6、TNF-α、MCP-1含量明显降低（P<0.01），ADPN水平显著升高，表明豆茶决明冲剂对高脂诱导的肥胖小鼠相关因子具有调节作用（表5）。

2.6各组小鼠相关炎症通路比较

与对照组相比，经高脂饲料喂养后模型组的p-IKKβ/IKKβ、NFκB、p-JNK/JNK比值升高，而LD、MD、HD组及RH组其比值明显低于模型组。见图1、表6。

3讨论

目前，公认脂肪细胞是一种内分泌细胞，脂肪组织是内分泌组织，其分泌的脂肪细胞因子是形成IR的原因之一。据此，我们认为肥胖、脂类代谢异常是导致IR 重要原因之一[6]。我们前期研究已经初步表明豆茶决明水煎液具有减肥、降脂、改善胰岛素抵抗作用[4]。本研究将豆茶决明制备为冲剂并对其作用机制进行探讨。实验结果显示，豆茶决明冲剂可降低IR 小鼠体质量、FPG 和INS 水平。豆茶决明降低小鼠的体脂重、TC和TG水平，减少脂肪组织的脂肪重量，明显降低FPG、INS和IRI，表明豆茶决明冲剂具有改善IR的作用。

肥胖是一种常见的慢性代谢性疾病，是基因、环境包括饮食环境等因素共同作用的结果[7]。胰岛素抵抗（IR）是指在各种原因的影响下使胰岛素对葡萄糖摄取和利用的效率下降，机体代偿性的分泌过多胰岛素而产生高胰岛素血症[8]。肥胖引起异位脂质积累和在骨骼肌中产生胰岛素脱敏，产生全身胰岛素抵抗和2型糖尿病[9]。在肥胖状态下，脂肪细胞会分泌一系列的细胞因子从而诱发免疫和炎症过程，这种免疫和炎症过程可能会参与胰岛素抵抗（IR）的发生及发展，相关的炎症因子主要含有白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）等[10]。除以上相关炎症因子外，也有研究发现脂肪因子（瘦素、脂联素）可能也参与了IR的产生。瘦素（leptin，LEP）由脂肪组织分泌，通过作用于下丘脑减少机体的食物摄入，增加能量消耗，从而调节整体的糖脂平衡和内分泌功能。研究表明在肥胖状态下，体内的LEP分泌显著升高，出现瘦素抵抗，此变化在胰岛素抵抗的发展中起重要作用[11]。脂联素（ADPN）主要也是由脂肪细胞分泌，具有提高胰岛素敏感性的作用[12]。我们的前期研究已经表明，豆茶决明可以抑制体重升高，改善糖、脂类代谢，抑制肥胖形成的作用[4]。本实验结果显示，豆茶决明冲剂能显著抑制小鼠血清TNF-α、LEP、MCP-1、IL-6浓度，增加ADPN含量，表明豆茶决明冲剂能有效地改善胰岛素抵抗小鼠的炎症反应。

研究表明脂肪组织与细胞中分泌的TNF-α、IL-6多种相关因子能够激活胰岛素靶细胞中的JNK、IKKβ炎性信号通路[13-15]。JNK是环境应激和炎症的关键调解者，属于丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族，被FFA、TNF-α、IL-6等炎症因子激活后使胰岛素受体底物（IRS）307位上丝氨酸磷酸化，减弱了胰岛素的行动，产生胰岛素抵抗[16，17]。IKKβ通路主要通过两种途径干扰胰岛素抵抗。IKKβ通路可直接作用于胰岛素信号通路中信号分子如胰岛素受体底物（IRS），并催化其特定部位的Ser/Thr残基磷酸化，进而抑制信号分子的Thr磷酸化，导致IR;也有研究认为被TNF-α、IL-6等炎症因子激活的IKK可以磷酸化IκB，使IκB和NF-κB解离，NF-κB转移到细胞核内与DNA靶基因相应位点结合生成mRNA，由此激活NF-κB信号通路，进而产生大量炎症细胞因子，然后进一步加速IR的形成[18，19]。近期许多研究表明，抑制JNK可抑制自噬，降低胰岛素抵抗[20]。高脂饮食通过增加JNK1的表达提高了JNK激活引起抑郁[21];高脂饮食通过激活脂肪组织炎症、JNK和NF-κB通路导致小鼠胰岛素抵抗[22，23]。激活IKKβ/NF-κB导致神经元损耗和分化受损，IKKβ/NF-κB介导的下丘脑成体神经干细胞损伤是肥胖及相关糖尿病的重要神经退行性机制[24]。木犀草素可以抑制相关血管的生成，改善高脂饲料诱导的小鼠肥胖及胰岛素抵抗（IR）[25，26];张磊等[27]研究也证明饮食补充木犀草素可以抑制高脂饮食诱导的脂肪组织巨噬细胞M1极化，降低脂肪組织中巨噬细胞及促炎细胞因子TNF-α、IL-6、MCP-1的mRNA的表达，从而改善高脂饮食诱导的脂肪组织慢性炎症的发生。综上研究表明，JNK和NF-κB通路是高脂诱导小鼠胰岛素抵抗重要炎症信号通路。本文对JNK、IKKβ炎性信号通路的研究表明，模型组小鼠实验结果同文献[22，23，27]一致，豆茶决明冲剂可以降低p-IKKβ/IKKβ的比值和抑制NF-κB表达，降低p-JNK/JNK的比值，证明豆茶决明冲剂可以抑制肥胖时最重要的致炎通路的激活。

通过对瘦素、脂联素、IL-6、TNF-α、MCP-1和对JNK、IKKβ通路的研究，我们认为豆茶决明冲剂可以抑制炎症因子和炎症通路的激活，从而改善肥胖产生的胰岛素抵抗。此研究为将豆茶决明开发成安全有效、无毒副作用的减肥产品奠定了基础。

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（收稿日期：2018-08-26）