microRNA-1在急性心肌梗死大鼠中的表达以及对心肌细胞凋亡影响

刘萍，赵光煊，王辉宇，赵强，刘泉，黄忠，张海勤，苏璟，张瑞波，刘海亮，张勇，原子旭

心肌梗死（M I）尤其是急性心肌梗死（AMI）是临床常见的一种心血管疾病，其发病率和死亡率逐渐升高，严重危害人类健康[1-3]。MicroRNAs（miRNA，miR）是一种具有组织特异性的非编码单链小分子RNA，具有高度保守性，由19～25个核苷酸组成，调控蛋白质的表达。研究表明，miRNAs在多种心血管疾病病理生理过程中发挥重要作用，如心肌肥厚、心律失常、心肌缺血等[4-6]。miR-1是一种心肌和骨骼肌特异性表达的miRNAs。大量的研究表明，miR-1参与心肌梗死的形成过程，并与心肌梗死面积密切相关[7,8]。但miR-1在心肌梗死中的具体作用机制尚未明确。本实验研究miR-1在心肌梗死的大鼠心肌组织中的表达量，并在体外构建低氧无血清心肌细胞损伤模型，模拟体内心肌细胞的缺血缺氧状态，探讨miR-1在心肌梗死中对心肌细胞凋亡的调节作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料30只SD大鼠，SPF级，周龄8～10周，体重270～310 g，购自中国科学院上海实验动物中心，H9C2细胞中科院上海细胞库，DMEM培养基、Trizol试剂、Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司，荧光定量PCR试剂盒、凋亡试剂盒购自美国Sigma公司，NC和miR-1 inhibitor购自广州锐博有限公司，半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）抗体，活化的Caspase-3（Cleaved Caspase-3）抗体购自美国Abcam公司。荧光定量PCR仪购自德国艾本德公司，流式细胞仪购自美国伯乐公司。

1.2 大鼠急性心肌梗死模型的建立及分组SD大鼠在适宜的温度、湿度中适应性饲养一周，随机分为3组：正常对照组、假手术组、模型组，每组各10只。模型组根据参考文献所示实验方法[9]，大鼠经麻醉后，连接动物呼吸机，开胸结扎其冠状动脉构建急性心肌梗死大鼠模型。假手术组大鼠仅开胸，不结扎其冠状动脉。正常对照组大鼠不做任何处理。造模成功后24 h，以10%水合氯醛麻醉各组大鼠，取远端缺血心肌组织为样本，检测miR-1的表达量。

1.3 评价指标

1.3.1 荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）检测miR-1的表达量取30 mg心肌组织，加入Trizol提取组织中总RNA，逆转录合成cDNA。采用荧光定量PCR试剂盒检测各组心肌组织样本中miR-1的表达量。反应条件为95 ℃ 3 min，95 ℃25 s，58 ℃ 2 min，72 ℃ 5 min，40 cycles。miR-1扩增引物上游序列为5，-CTGTCACTCGAGC TGCTGGAATG-3，，下游序列为5’-ACCGTGTC GTGGAGTCGGCAATT-3’；β-actin上游序列为5’-ATGGTGGGTATGGGTCAGAAGG-3’，下游序列为5’-TGCCTGGGGTGTT GAAGGTC-3’。结果以2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。

1.3.2 心肌细胞培养及分组H9C2细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基，放入37 ℃、CO2浓度为5%的细胞培养箱中，胰酶消化、传代。选生长状态良好的细胞随机分为3组：对照组、阴性组、抑制组；对照组常规培养，阴性对照组和抑制组分别在Lipofectamine 2000转染试剂介导下将NC、miR-1 inhibitor转染入H9C2细胞，加入不含血清DMEM培养基，放入37℃、5%CO2、1%O2、94%N2的细胞培养箱中继续培养，qPCR检测转染后miR-1的表达量。

1.3.3 细胞凋亡的检测收集各组细胞，培养48 h后，避光条件下每孔加入10 μl 膜联蛋白 V-FITC（Annexin V-FITC）、5 μl 碘化丙啶（PI），染色15 min，流式细胞仪检测细胞的凋亡率。

1.3.4 免疫印迹试验（Western Blot）检测细胞中Caspase-3蛋白表达量收集各组细胞，加入细胞裂解液，提取细胞中总蛋白。吸取蛋白样品测定浓度，并与适量缓冲液混合均匀，沸水加热5 min；吸取50 μg总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）中，5%的脱脂奶粉封闭1.5 h；加入一抗，Caspase-3 1：500，Cleaved Caspase-3 1：1000，4 ℃孵育过夜，PBST洗膜3次，加入二抗，37 ℃孵育2 h，PBST洗膜3次，避光，显色、拍照，Quantity One分析蛋白质灰度值与内参比值。

1.4 统计学分析SPSS 22.0软件进行统计处理，结果以平均数±标准差（±s）表示，多组数据间的比较采用单因素方差分析，组间多重比较使用SNK-q检验，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 荧光定量PCR检测miR-1在AMI大鼠中的表达与正常对照组相比，假手术组miR-1表达量无显著差异（P＞0.05），但在AMI大鼠缺血心肌组织中miR-1显著上调，差异具有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

2.2 转染miR-1 inhibitor后H9C2细胞中miR-1的表达量与对照组相比，阴性组miR-1表达量无显著变化（P＞0.05），但转染miR-1 inhibitor后H9C2细胞中miR-1显著下调，差异具有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

2.3 抑制miR-1表达对H9C2细胞凋亡的影响与对照组相比，阴性组H9C2细胞凋亡无显著变化（P＞0.05），但转染miR-1 inhibitor后H9C2细胞凋亡率显著下调，差异具有统计学意义（P＜0.05）（表3、图1）。

表1 miR-1在AMI大鼠缺血心肌组织中的表达（±s，n=10）

表1 miR-1在AMI大鼠缺血心肌组织中的表达（±s，n=10）

注：与正常对照组相比，aP＜0.05

组别 miR-1相对表达量正常对照组 1.005±0.018假手术组 0.978±0.094模型组 3.258±0.437a F值 77.014 P值 0.000

表2 转染后细胞中miR-1的表达量（±s，n=3）

表2 转染后细胞中miR-1的表达量（±s，n=3）

注：与对照组相比，aP＜0.05

组别 miR-1相对表达量对照组 1.003±0.015阴性组 1.032±0.096抑制组 0.483±0.037a F值 79.460 P值 0.000

2.4 抑制miR-1表达对H9C2细胞中Caspase-3表达量的影响Caspase-3蛋白在各组间表达量无显著差别；与对照组相比，阴性组Cleaved Caspase-3蛋白水平无显著变化（P＞0.05），但转染miR-1 inhibitor后H9C2细胞中Cleaved Caspase-3蛋白水平显著下调，差异具有统计学意义（P＜0.05）（表4、图2）。

3 讨论

AMI是临床上的一种常见病，其发病率逐渐增加。miRNAs参与AMI病理生理过程，近年来受到高度关注。miRNAs广泛表达，参与调控细胞的生长、分化过程，在机体的生长发育、疾病的形成过程中发挥重要作用。miRNAs转录后特异性识别靶基因的相应位点，通过碱基互补配对的方式进行结合，从而抑制靶基因的转录，阻碍其表达。近年来的研究发现，miRNAs的表达量与细胞的凋亡密切相关[10-13]。miR-1是一种在成熟心肌组织中特异性表达的miRNA，维持心脏功能以及调控多种心血管疾病的形成[14]。在过氧化氢诱导的心肌细胞中过表达miR-1，显著促进细胞的凋亡率，相反抑制miR-1的表达量，心肌细胞的凋亡率明显下调[15]。

表3 抑制miR-1表达对H9C2细胞凋亡的影响（±s，n=3）

表3 抑制miR-1表达对H9C2细胞凋亡的影响（±s，n=3）

注：与对照组相比，aP＜0.05

组别 细胞凋亡率（%）对照组 8.6 5 2±0.8 3 3阴性组 8.1 2 3±0.8 8 5抑制组 3.2 5 1±0.3 6 3 a F值 4 9.5 8 8 P值 0.0 0 0

图1 抑制miR-1表达对H9C2细胞凋亡的影响

表4 抑制miR-1表达对H9C2细胞中Caspase-3表达量的影响（±s，n=3）

表4 抑制miR-1表达对H9C2细胞中Caspase-3表达量的影响（±s，n=3）

注：Caspase-3为半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3；Cleaved Caspase-3为活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3；与对照组相比，aP＜0.05

组别 Caspase-3 Cleaved Caspase-3对照组 0.652±0.068 0.563±0.052阴性组 0.634±0.055 0.599±0.054抑制组 0.618±0.072 0.210±0.022a F值 0.203 68.126 P值 0.822 0.000

图2 抑制miR-1表达对H9C2细胞中Caspase-3表达量的影响

本实验通过构建急性心肌梗死大鼠模型，检测缺血区心肌组织miR-1的表达量，结果显示与正常对照组相比，miR-1的表达量显著上调。大量的研究表明，miR-1在心肌梗死组织和细胞中的表达量异常，可用于诊断心肌梗死的有效生物标记物[16-18]。miR-1与急性心肌梗死的缺血程度显著相关[19]，与本实验结果相一致，提示miR-1的表达量在急性心肌梗死的发生、发展过程中密切相关。

研究表明，心肌梗死过程中心肌损伤增加，其中心肌细胞的凋亡发挥重要作用，减少细胞的凋亡可有效抑制心肌损伤程度。因此探究心肌细胞凋亡的分子机制具有重要意义。细胞凋亡过程依赖于Caspase家族蛋白酶的级联反应。Caspase-3是细胞凋亡过程最终执行蛋白，正常情况下以酶原形式存在于胞浆中，但在细胞凋亡过程中，可被激活，Cleaved Caspase-3是Caspase-3激活后的活性产物，检测细胞Cleaved Caspase-3的活性可反应细胞的凋亡状态[20,21]。本实验通过体外以低氧、无血清培养H9C2细胞以模拟体内缺血过程，同时抑制miR-1的表达，结果显示，转染miR-1 inhibitor降低H9C2细胞中miR-1的水平；流式细胞仪检测细胞的凋亡率显示，抑制miR-1的表达显著降低H9C2细胞的凋亡率，减少Cleaved Caspase-3蛋白水平；说明miR-1通过Caspase-3的活化调节促进心肌梗死的心肌细胞的凋亡。

综上所述，本实验在急性心肌梗死的大鼠模型中发现miR-1的表达量显著升高，并通过体外缺氧、饥饿模拟心肌细胞体内缺血过程，验证miR-1对缺血缺氧H9C2细胞凋亡的调控作用。研究结果显示心肌缺血促进miR-1水平增加，而增多的miR-1可能通过调节Caspase-3的活化，促进细胞凋亡，但其具体的作用机制有待进一步的研究。