维生素C对存储红细胞的影响

杨丽丽，李旭研，孙明玥，李 姝，张丽华，魏春华，苏 燕

(包头医学院生物化学与分子生物学教研室，内蒙古 包头 014040)

体外存储的红细胞(red blood cells，RBCs)是临床输血的主要来源，随着血液存储时间延长，RBCs会发生一系列形态、功能、生物化学等方面的变化，即RBCs存储损伤。氧化应激通过促进蛋白质和脂质的氧化损伤，导致储存RBCs的生理学改变[1]，是RBCs储存损伤的主要原因，向储存RBC中添加适量抗氧化剂具有减轻氧化损伤的潜力[2]。维生素C是一种水溶性的抗氧化剂，J.S.Raval等的研究表明8.78 mmol/ L(生理浓度的150倍)的维生素C可以显著降低存储红细胞脆性和溶血，但对生化参数没有影响[3]。而Sean R.Stowell等的研究发现，3.6-10.8 mmol/L的维生素C可以改善鼠输血后恢复、同时减少微粒形成和同种异体免疫[4]等。但尚未见维生素C对存储期红细胞血红蛋白状态影响的报道。本研究拟向存储红细胞中加入维生素C注射液(终浓度10.8 mmol/L)，利用血气分析仪分别检测存储0 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d红细胞血气指标的改变，为研究RBCs存储损伤及红细胞保护提供理论及实验基础。

1 材料与方法

1.1血液的来源与制备 本研究经包头医学院伦理委员会审核批准，招募乙肝病毒、丙肝病毒、人类免疫缺陷病毒阴性，并无疾病家族遗传史的健康志愿者6名，嘱3 d内清淡饮食、适量运动，于3 d后分别采集全血400 mL于山东威高的采血四联袋内，经滤白器(四联袋自带)过滤白细胞后，4 795 g离心17 min，分离血浆和红细胞。红细胞与100 mL红细胞保护液MAP充分混匀后，用无菌接管机分成实验组和对照组，分好后准确称量血液质量并计算体积。对照组不做任何处理，实验组加入维生素C注射液(pH=7.0)，终浓度为10.8 mmol/L。存储红细胞均放入4 ℃冰箱保存。

1.2试剂与仪器 维生素C注射液(瑞阳制药)；一次性使用去白细胞塑料血袋(山东威高集团医用高分子制品股份有限公司)；离心机(Heraeus Cryofuge 6000i，德国Thermo Fisher)；无菌接管机(TSCDII，泰尔茂)；血气分析仪(ABL90，雷度)；全血细胞分析仪(sysmex800i)。

1.3方法 于储存期0 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d轻轻混匀血袋，从血袋小辫端无菌抽取RBCs 悬液2 mL，热和封闭血袋接口后，分别进行血气和血常规检测。

2 结果

2.1维生素C对存储期不同时间点红细胞携氧能力的影响 对实验组和对照组红细胞血氧值的各项指标数据分别进行独立样本t 检验比较，结果所示：随着存储时间的延长红细胞血氧饱和度(SO2)、氧合血红蛋白分数(FO2Hb)不断降低，维生素C组高铁血红蛋白分数(FMetHb)、还原血红蛋白分数(FHHb)不断升高。维生素C组SO2在第14d(P=0.004)、21d(P=0.000)、28d(P=0.000)、35d(P=0.000)与对照组比明显降低，差异有统计学意义；FO2Hb在第14d(P=0.005)、21d(P=0.002)、28d(P=0.000)、35d(P=0.000)与对照组比明显降低，差异有统计学意义；而FMetHb在第28d(P=0.036)、35d(P=0.010)与对照组比明显升高，差异有统计学意义；FHHb却在第7 d(P=0.001)、14d(P=0.000)、21 d(P=0.000)、28 d(P=0.000)、35 d(P=0.000)与对照组比明显升高，差异有统计学意义。详见表1。

表1 维生素C对存储期不同时间点红细胞血氧值的影响

a为与对照组比较，P<0.05

2.2维生素C对存储期不同时间点红细胞代谢物浓度的影响 对实验组和对照组红细胞代谢物浓度的各项指标数据分别进行独立样本t 检验比较，结果所示：随着存储时间的延长红细胞外葡萄糖(Glucose，GLU)浓度不断降低，而乳酸(lactic acid，Lac)、总胆红素(Total bilirubin，TBil)浓度不断升高。维生素C组TBil浓度在7 d(P=0.009)、14 d(P=0.029)、21 d(P=0.033)、28 d(P=0.040)、35 d(P=0.043)与对照组比明显升高，差异有统计学意义；GLU浓度却在35 d(P=0.007)与对照组比明显降低，差异有统计学意义；而Lac浓度维生素C组与对照组没有差异。见表2。

表2 维生素C对存储期不同时间点红细胞代谢物浓度的影响

a为与对照组比较，P<0.05

2.3维生素C对存储期不同时间点红细胞外离子浓度及红细胞平均体积(Erythrocyte mean corpuscular volume，MCV)的影响 对实验组和对照组红细胞外离子浓度及红细胞平均体积的各项指标数据分别进行独立样本t 检验比较，结果所示：随着存储时间的延长红细胞外Na+浓度不断降低，Cl-浓度和MCV没有显著变化。维生素C组Na+浓度在7 d(P=0.379)、14 d(P=0.016)、21 d(P=0.005)、28 d(P=0.005)、35 d(P=0.012)与对照组比明显升高，差异有统计学意义；Cl-浓度和MCV维生素C组与对照组没有显著变化。详见表3。

表3 维生素C对存储期不同时间点红细胞外离子浓度及红细胞平均体积(MCV)的影响

a为与对照组比较，P<0.05

3 讨论

维生素C是一种水溶性化合物，易溶解于保护液但不易透过脂质双层进入细胞，但人类RBC膜本身似乎具有吸收维生素C及其氧化衍生物的机制[5]，Padayatty SJ等认为维生素C作为一种电子供体被氧化成脱氢抗坏血酸(dehydroascorbic acid，DHA)，RBCs通过DHA途径获得维生素C[6]。血液中维生素C可保护生物膜免受水相中的过氧化损伤，并使Hb维持在还原状态。然而维生素C对RBCs的影响是浓度依赖性的，并且可以通过长期储存期间从红细胞释放的各种化合物来调节，例如 Hb降解产物、细胞因子、蛋白酶和/或活性脂质可以将其性质从抗氧化变为促氧化[8]。本研究结果表明，10.8 mmol/L维生素C组FMetHb、FHHb、TBil及细胞外Na+显著高于对照组，而SO2、FO2Hb及GLU明显低于对照组。维生素C作为一种还原剂，被存储红细胞外环境中的氧气氧化成为DHA，使存储红细胞外环境中氧分压降低，与血红蛋白结合的氧解离，所以SO2、FO2Hb降低，而FHHb却从第7 d开始显著高于对照组，所以从存储第7 d开始观察到维生素C组的血液呈蓝紫色。体外高浓度维生素C与红细胞的相互作用引起膜的脂质过氧化和血红蛋白的氧化导致红细胞氧化溶血[8-11]，释放出非结合胆红素，所以维生素C组TBil增加。血红蛋白因遭到高浓度维生素C的氧化导致FMetHb高于对照组。存储过程中由于腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)不足使ATP依赖性红细胞Na+-K+-ATP泵失活，导致存储RBCs外Na+浓度降低[12]。有学者[13]也证实在4 ℃的储存温度下，Na+/ K+泵失活性，导致Na+内流。但Na+浓度在存储的第7 d升高及存储末期维生素C组的GLU浓度低于对照组的机制及原因还有待进一步的验证。输血治疗的目的是恢复组织的供氧、血容量及血液粘度。因为从存储3 h到14 d存储环境中PO2保持恒定，而在整个存储期间血氧饱和度却持续增加，到第42 d达到99 %，这是由于ATP及2,3- DPG的消耗[14]使RBCs的氧亲和力增加[15]。2,3- DPG为Hb的变构效应物，可以稳定Hb的“脱氧”状态，因此2,3- DPG的降低会增加Hb的氧亲和力，使氧饱和度增加。而10.8 mmolL-1的vitC使存储期RBCs的SO2、FO2Hb低于对照组，FHHb高于对照组，再加上存储引起的Hb与O2的亲和力增加，所以输入这种血液以后，所以不利于恢复机体及组织的氧供。

4 结论

10.8 mmol/L维生素C实验组的Vitamin C对存储期红细胞具有促氧化作用，并且使血红蛋白脱氧。