桧木精油对实验性慢性咽炎动物模型的作用机制研究

蒋兆梅，杨应亮，胡必凤，谭志冠，麦国凤，阮 萍

（1.广西中医药大学瑞康临床医学院，广西 南宁 530011；2.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011）

慢性咽炎为咽部黏膜、黏膜下层及淋巴组织的弥漫性慢性炎症，常为上呼吸道慢性炎症的一部分。随着生活环境的改变，慢性咽炎的患病率急剧增高［1］。治疗慢性咽炎的方法很多，但传统中药见效慢，西医主要采用抗菌药物治疗，可能造成咽部正常菌群失调，效果不太理想。植物精油是由植物的根、茎、叶、花或果实通过挤压、蒸馏、萃取、析出等方式提炼出的一类重要次生物质，也称芳香油、挥发油，通常由数十种甚至数百种分子量小的简单化合物组成，其成分复杂多样［2－3］。研究表明，植物精油具有抑菌、抗氧化、杀虫等生物活性，如薄荷、尤加利、云杉及乳香精油等在多种疾病中都有一定的治疗作用［4－7］。Rantzsch等［8］发现，尤加利精油对慢性阻塞性肺疾病患者体内提取的肺泡巨噬细胞具有一定的抗炎作用。本研究使用的桧木精油是从红桧与扁柏中提取的，其主要成分是萜类化合物，具有抗炎症、抗肿瘤、抗氧化应激等作用［9－10］。本文旨在探索桧木精油在治疗慢性咽炎中的疗效及其可能存在的机制，现报道如下。

1 实验材料

1.1 动物 SD大鼠，SPF级，体质量200～220 g，雄性，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号：SCXK（湘）2016－0002。

1.2 药物与试剂 桧木精油（广西桧元素生物科技有限公司，批号：161101）；慢严舒柠清喉利咽颗粒（山西桂龙医药有限公司，国药准字Z20053117）；氨水（上海化学试剂有限公司，许可证编号：XK 13－2010279012Ⅱ；规格：每瓶500 ml；浓度：25%～28%）；白细胞介素－1β（IL－1β）、肿瘤坏死因子（TNF－α）试剂盒为上海蓝基生物产品，批号分别为20151008、20150903。

1.3 仪器 喉头喷雾器（江苏平安医疗器械有限公司）；ST－360酶标仪（上海科华实验系统有限公司）；T6紫外可见分光光度计（北京普利生有限公司）；高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有效公司产品）。

2 实验方法

2.1 造模及分组［11］将48只SD雄性大鼠随机分成空白组、模型组、桧木精油低剂量组（简称“桧低组”）、桧木精油中剂量组（简称“桧中组”）、桧木精油高剂量组（简称“桧高组”）、慢严舒柠清喉利咽颗粒组（简称“慢舒组”），共6组，每组8只。以苦味酸标记，并记录每只大鼠的重量，各组大鼠均用普通饲料喂养，自由饮水。模型组、桧低组、桧中组、桧高组、慢舒组动物第1～15天上、下午各用2.5%氨水喷其咽部1次，每次用喉头喷雾器喷3揿；空白组第1～15天同法予蒸馏水喷咽部。每日观察大鼠的纳食、活动量、饮水量、口腔分泌物及有无搔抓口咽部动作等，并每日观察大鼠咽部1次。模型组于第16天腹主动脉取血5 ml，随后处死，自大鼠环状软骨水平切断气管食管，取下咽部黏膜及其下组织以供作病理切片观察。造模完成后，第16～25天参照李仪奎《中药药理实验方法学》中的人与动物剂量换算方法［12］，慢舒组每天按9 g/kg剂量给药，用时以55℃蒸馏水配置成浓度为0.1 g/ml的溶液进行喷咽；桧低组、桧中组、桧高组每天剂量按0.25 g/kg、0.5 g/kg、1 g/kg给药，用时以 55℃蒸馏水配置成与慢舒组体积相等的溶液进行喷咽；空白组予同体积蒸馏水。

2.2 IL－1β及TNF－α含量测定 采用ELISA法检测IL－1β、TNF－α。样品处理：大鼠麻醉后腹主动脉取血5 ml左右置于抗凝采血管中，静置15 min后置离心机中2 000 r/min，取血清于－20℃保存备用。标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，按顺序编号，每连续2孔为一组，所加试剂、操作相同，稀释、弃液后各孔加样量都为50μl，TNF－α标准孔浓度分别为 240 ng/L，160 ng/L，80 ng/L，40 ng/L，20 ng/L；IL－1β 标准孔浓度分别为30 ng/L，20 ng/L，10 ng/L，5 ng/L，2.5 ng/L。加样：待测样品稀释5倍反应（待测样品孔中先加样品稀释液 40 μl，然后再加待测样品 10 μl），封板混匀，37 ℃温育30 min，浓缩洗涤液稀释后重复洗涤5次，拍干。加酶：除空白孔，每孔加入酶标试剂50μl，温育、洗涤同前。显色：每孔先后加显色剂A、B各50μl，摇匀，37℃避光显色15 min。终止：每孔加终止液50μl，终止反应。测定：以空白孔调零，在15 min内于450 nm波长处依序测量各孔的吸光度（OD值），依据标准品浓度与吸光度方程算出样品中 IL－1β、TNF－α 的浓度。

2.3 病理形态学观察 腹主动脉采血后，处死大鼠，暴露大鼠咽部并观察，取大鼠咽部组织，于4%甲醛溶液中固定，以100%、95%、85%、75%、60%梯度乙醇逐步脱水，二甲苯透明组织，石蜡包埋，切片约4μm，HE染色，中性树脂封片，并于光镜下观察各组大鼠咽组织病理变化，并进行分级评分［13］。评分标准共分5级：0分（－），正常结构，黏膜、固有膜层无水肿，无炎症细胞浸润；1分（＋），黏膜上皮增生不明显，固有层水肿，上皮下层轻度炎症细胞浸润；2分（＋＋），黏膜上皮轻度增生，上皮下层有炎症细胞浸润；3分（＋＋＋），黏膜上皮中度增生，上皮脚钉突形成并下延；4分（＋＋＋＋），黏膜上皮重度增生，腺上皮坏死，上皮下层有炎症细胞浸润。

2.4 统计学方法 采用SPSS20.0统计学软件处理，计量数据采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用方差分析；病理形态学观察的组间比较采用秩和检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

本次研究共纳入48只大鼠，造模15天后取模型组2只，用于病理切片观察大鼠咽部组织是否有慢性炎症改变，中途不明原因死亡6只。最后每组动物纳入统计的数量：空白组8只、模型组6只、桧高组6只、桧中组7只、桧低组8只、慢舒组7只。

3.1 桧木精油对大鼠一般状态的影响

3.1.1 纳食方面 造模后至给药前，造模组及给药组纳食均有减少，空白组无明显变化。给药后，给药组纳食有所增加。

3.1.2 活动情况 造模期间空白组活动量前后无明显变化；造模的组别在造模前2天喷氨水后，活动量增多，稍亢奋。给药期间，各组与造模期相比，除未出现亢奋外，活动量前后无明显改变。

3.1.3 饮水频率及24h饮水总量 空白组饮水频率及饮水量前后无明显改变，造模的组别喷氨水3天后饮水频率及饮水总量均明显增加，给药后，各组饮水量持续增加。

3.1.4 口腔分泌物 造模期间，造模组口腔、鼻腔分泌物增多，并时常搔抓口部。给药期间，各组口鼻分泌物有所减少。

3.1.5 咽部情况 造模3天后模型组咽部充血肿胀明显、色泽鲜红；15天后，咽部呈暗红色，光泽欠佳，经生理盐水、桧木精油、慢严舒柠清喉利咽颗粒干预治疗10d后，空白组咽部黏膜湿润有光泽；模型组见咽部黏膜慢性充血，毛细血管扩张，分泌物增多，有些可见黏膜萎缩，干燥少津；慢舒组咽部红肿减轻，分泌物较之前减少；桧低组和桧中组咽部仍有充血，但不如给药前严重；桧高组咽部仅轻度红肿，黏液少见。

3.2 桧木精油对慢性咽炎大鼠咽部组织病理形态学的影响 见图1～图6、表1。

正常组：咽部组织结构清晰，复层鳞状上皮光滑平整，固有层及黏膜下层未见水肿，仅可见散在淋巴细胞浸润，腺泡小叶结构完整（图1）。

模型组：大鼠咽部组织分界不清，黏膜上皮角化过度、脱落，固有层和黏膜下层水肿，小血管增生并扩张充血，大量炎性细胞浸润，腺小叶结构局灶破坏，腺上皮坏死（图2）。

慢舒组及桧低组：黏膜上皮欠光滑，上皮增生，黏膜下层有炎细胞浸润（图3、4）。

桧中组及桧高组：黏膜上皮角化过度，炎性渗出物较多，上皮增生，上皮脚下延并形成钉突，黏膜下腺体导管扩张，有黏液潴留，炎细胞聚集在黏膜及黏膜下层（图 5、6）。

图1 ～图6 各组大鼠咽部组织形态图 （×400）

表1 桧木精油对慢性咽炎大鼠咽部组织病理形态学的影响 （只）

表1显示，与空白组比较，模型组动物咽部组织病理学分级加重（P＜0.05）；与模型组相比，桧木精油各剂量组及慢舒组的实验动物咽部组织病理形态学分级均明显减轻（P＜0.05）。

3.3 桧木精油对慢性咽炎大鼠血清中IL－1β、TNF－α的影响 见表2。

表2 桧木精油对慢性咽炎大鼠TNF－α、IL－1β的影响 （x±s）

表2显示，与空白组比较，模型组TNF－α、IL－1β 水平均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，慢舒组TNF－α、IL－1β水平明显降低，桧木精油各剂量组对 IL－1β 水平的降低有明显作用（P＜0.05），桧木精油各剂量组能在一定程度上减少血清TNF－α的分泌，但差异无统计学意义（P ＞0.05）。

4 讨论

慢性咽炎为咽部黏膜、黏膜下层组织的弥漫性慢性炎症，常为上呼吸道慢性炎症的一部分。主要由不良习惯、职业因素、生活环境、身体因素、遗传因素和炎症引发［14］。慢性咽炎作为耳鼻咽喉科的常见病，其发病占咽喉部疾病的10%～12%，多发生于成年人，城市发病率高，尤以教师、歌手居多［15］。且治疗后极易反复发作，严重影响人们的正常生活。患者咽部常有异物感、痒感、灼热感、干燥感或微痛感，常因周围炎症的刺激，咽壁黏膜充血肥厚，呈暗红色，在咽后壁可见分散突起的小颗粒或成片如串珠状，其周围有扩张的血管网，表面有时附有黏液或脓性分泌物。萎缩性咽炎与干燥性咽炎黏膜干燥，萎缩变薄，色苍白发亮，常附有粘稠分泌物或带臭味的黄褐色痂皮。

本研究采用低浓度氨水直接喷雾法长时间刺激大鼠咽部黏膜，建立慢性咽炎大鼠模型，模型动物病理损伤和血清细胞因子指标变化与临床指标有一定的相似性，且操作方法简单安全，是目前使用最广泛的模型建立方法［11］。实验表明，在造模2天后，造模动物出现口鼻分泌物增多，搔抓口部，咽部组织充血肿胀等体征，造模结束后组织切片结果显示为咽部慢性炎症病理改变，提示造模成功。

采用低浓度氨水反复刺激大鼠咽部，形成局部组织急性炎症，血管通透性增高，释放多种炎症介质，加重和激活新的炎症反应，造成局部组织变质、渗出和坏死，病情容易迁延为慢性。实验结果显示：空白组咽部组织结构清晰，复层鳞状上皮光滑平整，固有层及黏膜下层未见水肿，仅可见散在淋巴细胞浸润，腺泡小叶结构完整；模型组大鼠咽部组织分界不清，黏膜上皮角化、脱落，固有层和黏膜下层水肿，小血管增生并扩张充血，大量炎性细胞浸润，腺小叶结构局灶破坏，腺上皮坏死，符合慢性炎症改变。经慢严舒柠清喉利咽颗粒和桧木精油干预后，局部炎症均有一定程度改善，与模型组比较，动物咽部组织病理学分级显著减轻，说明桧木精油对损伤的咽部黏膜组织具有修复作用。

在炎症反应过程中，细胞因子既是免疫系统的信息传递介质，又是神经、内分泌及其他系统和免疫系统相互联系的重要桥梁［16］。TNF－α是炎症反应的始动因子，由单核－巨噬细胞活化产生，可增高血管内皮细胞的通透性，促进淋巴细胞活化，并诱导其他细胞因子及TNF－α自身的合成与释放，共同促进炎症反应［17］。IL－1β是淋巴细胞刺激因子，主要由活化的单核－巨噬细胞产生，局部低浓度时主要发挥免疫调节作用，局部高浓度时产生内分泌效应。炎症发生时，IL－1β主要介导趋化作用，参与白细胞的渗出和激活，加重炎症反应［18］。实验结果显示：与空白组比较，模型组的TNF－α及IL－1β均明显升高，提示这两种炎症介质参与了慢性咽炎的发病进程。桧木精油各剂量组及慢舒组血清可能通过降低这两种炎症介质的释放，从而减轻炎症反应，抑制炎症进程。

综上所述，桧木精油治疗慢性咽炎的可能机制为：减少组织的变性和坏死，降低血管的通透性、减少炎症细胞的组织浸润，促进组织修复；降低血清TNF－α、IL－β等炎症介质水平，促进炎症消除。本研究为桧木精油的抗炎作用提供了新思路，也为将来桧木精油在临床应用方面提供了理论基础。往后我们将进一步探讨桧木精油对炎症介质的作用机制，为其临床应用提供可靠的证据。