TLR4-/-DF1细胞系感染NDV后免疫机制的初步研究

王 辉，鲁国涛，许 曼，曾为俊，邵玉乐，赵丽丽，陈洪岩，刘建华，孟庆文*

(1.新疆农业大学 动物医学学院，新疆 乌鲁木齐830000；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室，黑龙江哈尔滨150069)

天然免疫是机体防御病原微生物感染的第一道防线，能够迅速启动抵御病原微生物的侵入，在机体防御机制中具有重要作用。模式识别受体(PRR)介导感染的识别，诱导细胞内信号级联传导引起炎性介质的转录表达，调节病原体和感染细胞的清除[1]。TLR4(Toll Like Receptor 4)属于Toll样受体家族，主要识别革兰氏阴性菌细胞壁LPS。自1999年Hoshino等发现TLR4为细菌LPS的受体以来[2]，其在细菌方面的研究便逐渐深入。2006年，Montminy等发现鼠疫杆菌LPS的脂质A可刺激TLR4二聚体结合MD2和CD14通过MyD88途径完全克服其毒力因子[3]。Kawai等发现TLR4通过MyD88依赖和非依赖通路诱导促炎因子和I型干扰素(IFN-I)的产生，激活机体的天然免疫应答，清除病原微生物[4]。近几年发现TLR4在病毒感染的发生及逃逸的过程中同样发挥重要作用，Lagos等发现缺乏TLR4的内皮细胞对卡波西肉瘤疱疹病毒(KSHV)感染更为敏感[5]；Haddadi等发现在禽巨噬细胞中TLR4的表达可抵抗感染性喉气管炎病毒(ILTV)[6]；Qu等发现在新城疫病毒(NDV)感染期间，TLR4受体与内源性蛋白高迁移率族组B1(HMGB1)相互作用并参与炎性细胞因子产生，TLR4通过MyD88依赖性途径传递信号激活NF-κB途径，从而促进炎性细胞因子过度表达[7]。NDV感染被证实引起强烈的炎症反应，导致过度的细胞凋亡和组织损伤，关于鸡TLR4对细菌感染应答的研究较多，但其在病毒感染中的作用研究甚少，侯巍等研究发现TLR2和TLR4参与了鸡体对NDV的感染应答[8]。另外，Cheng等研究发现NDV感染过表达鸡TLR3的DF1细胞，可显著抑制病毒P蛋白表达，敲低鸡TLR3后显著增高病毒P蛋白表达量，表明鸡TLR3同样在NDV感染中起抗病毒作用[9]。

CRISPR/Cas是细菌和古细菌中的适应性免疫系统，是设计开发的基因编辑重要工具[10]。该技术利用基因敲除、敲入及定点突变的方式，近几年在筛选病毒发病机制相关宿主因子方面发挥重要功能[11]。该技术已广泛应用于各个物种，在宿主抵抗病毒和免疫机制研究方面取得重要进展[12-15]。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TLR4基因敲除的DF1细胞系，为在细胞水平研究禽TLR4基因的抗病毒作用提供了良好的模型；将NDV感染该细胞并检测其主要下游接头蛋白、炎性因子及干扰素转录水平的变化，在天然免疫应答方面初步探究了NDV的致病机制和为病毒感染的疾病防控提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 DF1细胞、pCAG-Cas9-EGFP质粒、pUC19-sgRNA质粒及NDV La Sota株均由本实验室保存。ExTaqDNA聚合酶、E.coliDH5α感受态细胞和DNA Marker购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒、DNA纯化及胶回收试剂盒购自Axygen公司；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；各种限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自New England Biolabs公司；TLR4兔源多克隆抗体购自天德悦(北京)生物科技有限责任公司；GAPDH抗体购自成都正能生物技术有限公司；IRDye 680LT羊抗兔IgG购自LICOR公司；SYBR Green qPCR SuperMix购自TransStart公司；MTS试剂盒购自Promega公司。

1.2 sgRNA及相关鉴定引物的设计与合成 鸡TLR4为I型跨膜蛋白，分为胞外、胞内和跨膜3个部分。利用哈佛大学张峰实验室提供的网站(http://crispr.mit.edu)在胞外区的第二外显子处选择得分较高、特异性较好的2条sgRNA，并命名为TLR4-sgRNA1和TLR4-sgRNA2，在正义链模板的5'端添加CACC，反义链模板的5'端添加AAAC，与BbsⅠ酶切后形成的黏性末端互补。并根据敲除靶点位置设计PCR鉴定引物chTLR4-S。由于CRISPR/Cas9系统在非靶位点发生错配也有发生切割的可能性称为脱靶(Off-target)。根据网站提供的潜在脱靶位点设计合成3对鉴定引物TLR4-OT-1、TLR4-OT-2和TLR4-OT-3。表1为设计的PCR检测引物序列。

表1 TLR4基因PCR检测引物序列Table 1 PCR primer sequence of TLR4 gene

1.3 pUC19-TLR4-sgRNA1/2载体的构建与鉴定利用BbsⅠ酶切pUC19-U6-sgRNA质粒，电泳后回收线性化质粒。利用表1的TLR4-sgRNA1和TLR4-sgRNA2寡核苷酸单链退火形成双链；将回收的线性化质粒与退火产物连接、转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆，提取质粒、测序比对。构建的pUC19-TLR4-sgRNA1和pUC19-TLR4-sgRNA2分别与pCAGCas9-EGFP质粒构成双质粒表达系统。

1.4 TLR4-/-DF1细胞系的构建与鉴定 待6孔板中的野生型(Wild type，WT)DF1细胞密度达到70%～80%时，将构建的pUC19-TLR4-sgRNA1、pUC19-TLR4-sgRNA2分别与pCAG-Cas9-EGFP质粒共转染至WT DF1细胞；36 h～48 h后，倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)表达，流式细胞仪分选GFP表达的DF1细胞至96孔板，每孔1个细胞；待细胞传代时提取部分细胞基因组DNA，采用表1的chTLR4-S引物PCR扩增鸡TLR4基因；产物经电泳检测，回收纯化后测序比对，筛选TLR4基因敲除的DF1细胞系。

1.5 TLR4-/-DF1细胞的TLR4蛋白表达检测 将筛选的细胞传至六孔板中，长满后使用细胞刮刮下细胞，裂解细胞蛋白进行SDS-PAGE。电泳完毕后，转移至PVDF膜上，采用5%的脱脂奶粉封闭，以兔源TLR4多克隆抗体(1∶500)和兔源GAPDH抗体(1∶5 000)为一抗，羊抗兔IgG(IgG-HRP)(1∶15 000)为二抗，western blot检测TLR4-/-DF1细胞的TLR4蛋白表达。

1.6 TLR4-/-DF1细胞增殖速度分析 按照MTS试剂盒操作说明书对TLR4-/-DF1细胞进行细胞增殖速度测定。

1.7 TLR4-/-DF1细胞的脱靶检测 提取TLR4-/-DF1细胞基因组DNA，以表1中的TLR4-OT-1、TLR4-OT-2和TLR4-OT-3引物进行PCR扩增，扩增产物通过凝胶电泳观察是否出现非靶点切割。

1.8 NDV感染TLR4-/-DF1细胞及NDV拷贝数的检测 将MOI 2的NDV La Sota株感染六孔板中的TLR4-/-和WT DF1细胞，1 h后，换维持液继续培养。感染6 h、16 h和36 h后收集细胞上清液离心去除细胞碎片后提取病毒RNA，反转录为cDNA。采用表2中根据GenBank NDV的F蛋白基因设计的NDV绝对荧光定量检测引物扩增上清液中病毒基因，以构建的NDV质粒做标准曲线，计算病毒基因拷贝数。

表2 荧光定量PCR检测引物序列Table 2 Real-time PCR primer sequence

1.9 NDV感染TLR4-/-DF1细胞后下游接头蛋白MyD88转录水平检测 收集感染后6 h、16 h和24 h的TLR4-/-DF1细胞提取细胞RNA，反转录为cDNA。利用表2中根据GenBank鸡下游接头蛋白MyD88基因设计的荧光定量引物检测感染细胞中该基因的转录水平。

1.10 TLR4-/-DF1细胞NDV感染后细胞因子、干扰素转录水平检测 利用表2中根据GenBank鸡细胞因子IL-1β和IL-8、干扰素IFN-α和IFN-β基因设计的荧光定量检测引物检测感染细胞中以上基因的转录水平。

1.11 统计学方法 用Prism 6统计学软件分析数据，以平均数±标准差(±S)表示，采用单因素方差分析进行统计学分析，*：p<0.05表示差异性显著，**：p<0.01表示差异性极显著。

2 结果

2.1 双质粒表达系统的构建及共转染DF1细胞将设计合成的鸡TLR4sgRNA退火形成双链，插入BbsⅠ酶切的线性化pUC19-sgRNA质粒中，提质粒测序。将测序结果与设计的sgRNA比对，结果显示2条sgRNA均已分别插入线性化pUC19-sgRNA质粒中。表明重组质粒载体pUC19-TLR4-sgRNA1和pUC19-TLR4-sgRNA2正确构建。将2种重组质粒载体分别与pCAG-Cas9-EGFP质粒共转染DF1细胞，以空白载体作为阴性对照。使用倒置荧光显微镜观察可见，转染后的DF1细胞多数表达绿色荧光，对照组不表达绿色荧光(图1)。表明pCAG-Cas9-EGFP质粒转染进入DF1细胞。

2.2 TLR4-/-DF1细胞的鉴定结果 流式细胞仪分选表达绿色荧光GFP的DF1细胞，传代后提取细胞基因组，使用表1中chTLR4-S引物进行PCR扩增，结果显示28号样品条带小于WT对照，且未出现与WT相同大小的条带(图2A)，通过测序比对，确认28号细胞比WT细胞的TLR4基因缺失74 bp(图2B)，能够造成移码突变，命名为TLR4-1-28。表明通过初步筛选得到1株TLR4-/-DF1细胞。

图1 双质粒系统转染DF1细胞Fig.1 Transfection of double plasmid system into DF1 cells

图2 TLR4基因的PCR扩增(A)及测序结果(B)Fig.2 PCR amplification of TLR4gene(A)and results of sequencing(B)

2.3 TLR4-/-DF1细胞TLR4蛋白表达的检测结果将TLR4-1-28传代培养，提取细胞蛋白进行western blot检测，结果显示TLR4-1-28细胞没有目的条带，而WT细胞有90 ku的目的条带(图3)，表明TLR4-/-DF1细胞TLR4蛋白不表达，得到一株TLR4-/-DF1细胞。

2.4 TLR4-/-DF1细胞与WT DF1细胞增殖速度比较 采用MTS试剂盒检测细胞的增殖速度，结果显示，TLR4-/-DF1细胞与WT DF1细胞的生长速度无显著差异(图4)。表明，TLR4基因的部分缺失不影响细胞的生长。

2.5 TLR4-/-DF1细胞脱靶检测结果 采用表1中的TLR4-OT-1、TLR4-OT-2和TLR4-OT-3引物进行PCR扩增TLR4-1-28细胞基因组DNA，结果显示TLR4-/-DF1细胞与WT细胞条带大小相同(图5)，无非特异性切割。表明TLR4-/-DF1细胞检测的3处潜在脱靶的位点均未出现脱靶现象。

图3 Western blot检测TLR4-/-DF1细胞TLR4蛋白表达结果Fig.3 The expression of TLR4 protein in TLR4-/-DF1 cells was detected by western blot

图4 TLR4-/-DF1细胞与WT DF1细胞的生长曲线Fig.4 The growth curves of TLR4-/-DF1 cells and WT DF1 cells

图5 TLR4-/-DF1细胞脱靶的PCR检测结果Fig.5 Detection of the off-target effect inTLR4-/-DF1 cells using PCR

2.6 TLR4-/-DF1细胞感染NDV的病毒拷贝数结果采用表2中的NDV引物经绝对荧光定量PCR扩增NDV感染后的TLR4-/-DF1细胞cDNA，结果显示NDV感染后16 h，TLR4-/-细胞与WT细胞相比病毒复制量显著升高(p<0.01)(图6)。

2.7 TLR4-/-DF1细胞感染NDV后TLR4下游接头蛋白MyD88转录水平检测结果 采用表2中的MyD88引物经相对荧光定量PCR扩增感染NDV的TLR4-/-DF1细胞反转录产物，结果显示感染后6 h及24 hTLR4-/-细胞与WT细胞相比MyD88转录水平显著降低(p<0.05)，16 h其转录水平无显著差异(图7)。结果表明，敲除TLR4能在一定程度上影响主要下游接头蛋白MyD88的转录水平。

图6 NDV感染后TLR4-/-DF1细胞中病毒拷贝数检测结果Fig.6 Detection of viral gene copy number inTLR4-/-DF1 cell upon NDV infection

2.8 TLR4-/-DF1细胞感染NDV后细胞因子及干扰素转录水平检测结果 采用表2中的IL-1β、IL-8、IFN-α、IFN-β引物经相对荧光定量PCR扩增感染NDV的TLR4-/-DF1细胞反转录产物，结果显示WT及TLR4-/-DF1细胞中IL-1β及IL-8转录水平在感染后16 h显著上升(p<0.01)，24 h时显著下降至起始水平(图8A、8B)。WT及TLR4-/-DF1细胞中IFN-I转录水平在感染后16 h显著上升(p<0.05)，24 h时显著下降至起始水平；同一时间点TLR4-/-细胞与WT细胞相比IFN转录水平均显著降低(p<0.05)(图8C、8D)。以上结果表明，敲除TLR4能在一定程度上促进NDV的增殖，影响主要细胞因子及干扰素的转录水平。

图7 NDV感染后TLR4-/-DF1中MyD88转录水平检测结果Fig.7 Detection of the transcription of MyD88 inTLR4-/-DF1 cells upon NDV infection

图8 NDV感染后TLR4-/-DF1中IL-1β、IL-8、IFN-α及IFN-β转录水平检测结果Fig.8 Detection of the transcription of IL-1β,IL-8,IFN-α,and IFN-β inTLR4-/-DF1 cells upon NDV infection

3 讨论

TLR4主要通过依赖MyD88途径，一方面激活NF-κB，诱导细胞因子产生，促进炎症或免疫调节功能；另一方面激活IRF3/7，诱导IFN-Ⅰ和ISGs的表达，发挥抗病毒作用[16]。本研究利用荧光定量PCR检测发现DF1细胞中TLR4缺失后感染的NDV复制量显著升高，感染后16 h时升高了2.95倍；同一时间检测到IFN-Ⅰ(IFN-α和IFN-β)的转录水平显著降低，接头蛋白MyD88的转录水平显著降低。由以上结果表明TLR4可抑制NDV复制，推测TLR4可能是通过诱导MyD88依赖途径产生IFN-Ⅰ(IFN-α和IFN-β)，从而清除NDV。

NDV感染鸡后引起脾、淋巴结及外周血中炎性细胞因子的强烈表达，引起感染鸡急性的高死亡率[5]。本研究中荧光定量PCR检测发现NDV感染TLR4-/-DF1后促炎性因子IL-1β和IL-8转录水平显著或极显著降低，IL-1β转录水平分别降低了44.8%、48.5%及43.8%，IL-8水平分别降低了30.1%、62.5%及49.1%。表明TLR4在NDV感染的细胞中引起的强烈炎性反应中发挥了至关重要的作用，因此TLR4可作为在控制病毒感染后引起强烈炎症反应方面开发抗病毒药物的重要靶点，推测可在临床应用TLR4阻断剂减轻NDV感染后的强烈炎症反应，降低急性死亡率，减少经济损失。

CRISPR技术是一种广泛应用于宿主及细菌、病毒基因组或其转录产物，并对其进行精确修饰的技术。但该系统仍然存在需要改进的方面，其可能存在的脱靶风险影响了该技术的深入研究，增加了其用于疾病治疗的风险，阻碍了临床的进一步应用[17]。针对此风险本研究对构建的TLR4-/-DF1细胞进行了脱靶效应分析，根据哈佛大学张峰实验室的sgRNA设计工具(http://crispr.mit.edu)提供的潜在脱靶位点设计引物进行扩增，结果均未发现脱靶状况，表明敲除前期分析TLR4基因序列并按照专业网站及设计原则对sgRNA进行设计并筛选的重要性和有效性。表明本实验中通过筛选特异性高的sgRNA、优化Cas9及sgRNA质粒的转染比例及不使用病毒载体等手段可有效降低脱靶效应，除此之外还可对Cas9蛋白进行改造产生切口酶或灭活的dCas9进行多位点同时编辑、利用Cas9/sgRNA核糖核蛋白(Riboncleoproteins，RNPs)递送系统以及修饰sgRNA来降低脱靶效应[12]。既保证CRISPR系统的高编辑效率，同时降低脱靶效应，这将是CRISPR/Cas9技术走向临床应用必须解决的问题。

本研究通过CRISPR/Cas9技术构建的TLR4-/-DF1细胞的NDV感染实验证明，TLR4在NDV感染后引起的强烈炎性反应及识别和清除病毒中发挥了重要的作用。本研究构建的细胞系可为禽病天然免疫防控研究提供新的思路。为了探究其他模式识别受体和下游接头蛋白是否对TLR4先天免疫应答途径起协同及代偿作用，本实验下一步可继续研究其他相关因子的表达情况，进一步揭示TLR4在病毒感染和清除中的功能。