交感神经对青年和老龄小鼠肠道上皮细胞增殖和抗氧化功能的影响

柯妍妍，陈素云，陈淑珍,2,3，兰天舒,2,3，武闯,2,3，林琳,2,3，林真亭，隋华秀,2,3

（1 厦门医学院基础医学部，厦门 361023 ；2 机能与临床转化福建省高校重点实验室，厦门 361023；3 厦门医学院呼吸病研究所，厦门 361023 ）

随着社会经济的不断发展和人口老龄化趋势的逐渐加快，我国成为了世界上老龄人口首个突破 2亿人的国家[1]。由于老龄人不够健康的生活方式和身体机能的退化，使得老龄人的晚年生活受着诸多疾病的困扰。其中胃肠疾病在老龄人群中相当普遍，肠炎、肠癌的发病率呈上升趋势，严重威胁老龄人身心健康。政府、企业均启动了大量项目，从病原学、流行病学等角度研究病原菌对患者的致病机制，但往往忽视了机体自身的调控能力。胃肠道不仅是消化吸收的场所，也是抵御病原菌感染的第一道屏障。肠道黏膜屏障由机械屏障、化学屏障、免疫屏障与生物屏障共同构成，其中机械屏障最为重要[2]，机械屏障指的是完整的彼此紧密连接的肠黏膜上皮结构。作者前期的研究表明交感神经能够对脾脏的淋巴细胞活性[3,4]和小肠的免疫屏障有调控作用[5]，但随着年龄增长交感神经对于小肠黏膜机械屏障影响的研究尚不完善。本研究应用六羟多巴胺（6-OHDA）化学性损毁交感神经，建立交感神经损毁模型，探索交感神经对青年和老龄小鼠小肠上皮细胞增殖的调节水平，以期为交感神经对增龄情况下小肠机械屏障的影响提供一定的理论依据。

材料与方法

1 实验材料

雄性ICR 小鼠购自厦门大学实验动物中心; 六羟多巴胺6-OHDA（Sigma 公司产品），组织切片机（德国徕卡公司）；光学显微镜（奥林巴斯）；组织切片拍照软件Motic DigiLabll；图像积分光密度（IOD）分析软件为Image-Pro Plus（IPP）；(METASH-V-5100)型紫外-可见分光光度计；增殖细胞核抗原（PCNA）单克隆抗体为Sigma 公司产品；羊抗小鼠IgG 为Multi Science 公司产品；总抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒均购自南京建成生物工程有限公司。

2 实验动物及交感神经损毁方法

选用健康的雄性ICR 小鼠28 只，其中3m 龄和18m 龄的各14 只（购自厦门大学实验动物中心）。两种月龄的小鼠均随机分为对照组和实验组（每组7只）。本文中3 月龄的小鼠定义为青年小鼠，18 月龄小鼠定义为老龄小鼠[6]。小鼠自由采食、饮水，光照制度为14L∶10D。正常饲养7d 后，进行如下处理：采用腹腔注射6-OHDA，剂量为100mg/kg 体重，溶于含0.01%抗坏血酸的灭菌生理盐水中，注射前新鲜配制，连续注射5d，每天一次。对照组以同样方式及时间给予相同剂量的抗坏血酸灭菌生理盐水。停药后5d 取材。

3 组织切片及常规HE 染色

停药后第5d 将小鼠颈椎脱臼处死，剖腹，取空肠中段，生理盐水冲洗内容物后，用4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（pH7.4）固定24h 以上，石蜡包埋, 用组织切片机制备连续横断切片，厚6μm，每隔15 张取1 张，进行HE 染色。统计方法为每只小鼠小肠取5 张切片，每张切片中选取5 根最长，走向平直伸展良好的绒毛，测量绒毛长度、最深隐窝深度及V/C 比值（指绒毛长度与隐窝深度的比值）。

4 PCNA 免疫组织化学染色

每只动物随机选取5 张切片（每隔15 张切片取1 张），石蜡切片常规脱蜡至水，微波抗原修复20min，冷却至室温后，用100%甲醇配制的3%H2O2封闭内源性过氧化物酶30min 和10%正常羊血清室温下作用30min 后，加小鼠抗人增殖细胞核抗原（PCNA）单抗（1∶2000），4℃过夜，PBS 洗涤后，用HRP 标记羊抗小鼠IgG 二抗（1∶250）于室温 2h,DAB- H2O2呈色，苏木精复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照组染色用PBS代替一抗。

5 小肠PCNA 阳性细胞数量的统计及光密度的分析

每张切片选取10个面积最大接近圆形的完整肠腺，测量每个肠腺的面积，用光学显微镜在40 倍物镜下观察统计每个肠腺上皮表达PCNA 的阳性细胞数并用组织切片拍照软件拍照并测量肠腺面积，最后计算出每平方毫米面积内PCNA 的阳性细胞数量，各指标取平均数作为测定数据。PCNA 的光密度值使用IPP 软件进行分析。

6 小肠抗氧化指标的测定

每只小鼠取空肠5cm 长，用生理盐水冲洗内容物，称取重量后用液氮冻存。待测试时将其取出匀浆，小肠匀浆中的T-AOC、MDA、GSH-Px 和SOD活性在紫外-可见分光光度计上测定，测定过程严格按照试剂盒说明书执行。

7 统计学分析

采用SPSS 17.0 统计软件分析，对测量数据进行Independent-Samples T test 分析。实验结果用平均数±标准误表示，0.01＜P＜0.05 为差异有显著性，P＜0.01 为差异极显著。

结 果

1 6 -OHDA 对青年和老龄小鼠绒毛长度、隐窝深度的影响

青年和老龄小鼠空肠的绒毛长度和隐窝深度在表1 中列出。经6-OHDA 处理后，青年6-OHDA 组比青年对照组的绒毛长度下降了12.1%，隐窝深度却上升了19.2%。老龄6-OHDA 组也比老龄对照组降低了4.6%，差异显著，隐窝深度无显著差异。在V/C 比值上，6-OHDA 阻断后，青年组和老龄组分别下降了26.3%和11.4%。

2 6 -OHDA对青年和老龄小鼠小肠PCNA阳性表达的影响

PCNA 阳性细胞主要表达于小肠肠腺和绒毛底端（图1A）。在青年和老龄组，6-OHDA 处理后肠腺PCNA 阳性细胞数比同龄对照组均有降低，青年对照、青年6-OHDA、老龄对照和老龄6-OHDA 组肠腺中PCNA 阳性细胞数量依次为10826.7、6520.86、9547.86 和9050.86 个/平方毫米。阻断后青年组与同龄对照组相比降低了39.8%；老龄组下降幅度较小，为5.2%（图1B）。对PCNA 阳性细胞的IOD值测定分析显示，青年6-OHDA 组PCNA 免疫反应性比同龄对照组降低25.3%，老龄组则无显著差异（图1C）。

表1 3 月龄和18 月龄小鼠小肠空肠绒毛长度、隐窝深度和V/C 比值Tab. 1 The intestinal villus height, crypt depth and the ratio of villus height to crypt depth (V/C) in jejunum of 3-month-old and 18-month-old mice after 6-OHDA treatment

图1 6-OHDA 处理对3 月龄和18 月龄小鼠小肠肠腺上皮PCNA 表达的影响。A，免疫组织化学检测（标尺，30µm）；B，PCNA 阳性细胞密度统计学分析；C，PCNA 免疫反应性统计学分析；*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01Fig.1 Effect of 6-OHDA treatment on PCNA expression in intestinal gland epithelial cells of 3-month-old and 18-month-old mice. A, immunohistochemical examination (scale bar, 30µm); B, statistical analysis for density of PCNA positive cells; C, statistical analysis for PCNA immunoreactivity;*, 0.01＜P＜0.05; **, P＜0.01

3 6 -OHDA 对青年和老龄小鼠小肠抗氧化酶活性的影响

在对小肠组织抗氧化酶含量的测定中表明，老龄对照小鼠SOD、GSH-Px 以及T-AOC 的含量均低于青年对照组。6-OHDA 处理后，青年组SOD、GSHPx 和T-AOC 分别下降38.3%、22.3%和22.1%，而老龄组下降程度略低，为12.5%、8.6%和16.7%。在MDA 的含量上，青年和老龄6-OHDA 组分别比同龄对照组上升31.4%和17.9%（图2）。

图2 6-OHDA 对3 月龄和18 月龄小鼠小肠组织SOD，GSH-Px，T-AOC 和MDA 含量的影响。*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01。Fig.2 The effects of 6-OHDA on SOD, GSH-Px, T-AOC and MDA content in intestine tissues of 3-month-old and 18-month-old mice after 6-OHDA treatment. *, 0.01＜P＜0.05; **, P＜0.01

讨 论

机械屏障的结构基础为完整的肠黏膜上皮细胞以及上皮细胞间的紧密连接。正常情况下肠黏膜上皮细胞、细胞间紧密连接与菌膜三者构成肠道的机械屏障，能有效阻止细菌及内毒素等有害物质透过肠黏膜进入血液[2]。小肠的机械屏障结构与营养物质消化吸收有着密切的关系。小肠的绒毛长度、隐窝深度、绒毛宽度、V/C 比值等指标，都是衡量小肠消化吸收功能的重要指标[7]，绒毛的长度与其肠上皮细胞数量呈显著相关，当肠上皮细胞数量增多时，绒毛变长，吸收能力增强，反之亦然。同样，V/C 比值也反映了小肠的功能状态，比值上升，则消化吸收功能增强，生长发育加快；比值下降，表明消化吸收功能下降，消化吸收功能降低[8]。许多病理因素都会影响损伤小肠机械屏障，如颅脑损伤、肝硬化、休克[9-12]等，但在生理情况下，小肠机械屏障调控因素的研究却比较少。作者在前期已经成功建立了利用6-OHDA 化学性损毁交感神经的模型[3]，其机制为6-OHDA 被去甲肾上腺素能受体摄取后，被传输至交感神经末梢，发生自体氧化，形成毒性分子，导致交感神经末梢损毁，但对神经元胞体没有作用[13]。本实验结果表明，使用6-OHDA 化学性阻断交感神经后，青年和老龄小鼠的绒毛长度、V/C比值和同龄对照相比均显著下降，但是隐窝深度只有在青年6-OHDA 组显著加深，老龄组则无显著差异。说明交感神经在维持青年和老龄小鼠的小肠正常黏膜形态方面都有着正面的调控作用，它能够有效地改善小肠黏膜的机械屏障，提高小肠对营养物质吸收的能力，进而维持小鼠的生长发育，但是在老龄鼠的调控程度和青年鼠相比略低，表现为阻断后老龄鼠绒毛长度下降程度低于青年组。

为了进一步探明化学性阻断交感神经影响小肠绒毛生长的机制，我们检测了小肠中增殖细胞核抗原（PCNA）的表达。PCNA 是一种分子量为36kD的蛋白质，在细胞核内合成，并存在于细胞核内，为DNA 聚合酶δ 的辅助蛋白。在G0～G1期细胞中无明显表达，G1晚期，表达大幅度增加，S 期达到高峰，G2～M 期明显下降，PCNA 量的变化与DNA合成一致，检测其在细胞中的表达，可作为评价细胞增殖状态的一个指标[14]。PCNA 免疫染色基本着色于细胞核上，阳性物质表现为弥散或颗粒的形式，或二者兼有，强阳性细胞的胞核呈棕黄色，阳性细胞的核呈黄色。细胞的增殖旺盛区在隐窝部，向绒毛顶部分化类似“扶梯”运动[15]。正常情况下，隐窝基部的细胞不断地分化并向绒毛的端部迁移，形成具有吸收能力的肠上皮细胞，以补充绒毛正常脱落的肠上皮。如果此过程减慢，肠腺细胞增殖减弱，则绒毛长度变短，V/C 比值下降。本实验观察到，PCNA主要在小肠的肠腺细胞上表达，这与以前报道的结果相符。化学性阻断交感神经后，青年、老龄小鼠肠腺上皮PCNA 阳性细胞数量均低于相应对照组，且差异显著，青年组的下降幅度更大。为了量化不同组别的阳性物质，我们进一步对肠腺上皮PCNA的积分光密度（IOD）值进行了比较，IOD 的值与样品上特定区域所含的阳性物质总量成正比[16]，从结果中可以看到，6-OHDA 处理的青年、老龄小鼠肠段中PCNA 阳性细胞的IOD 值均低于同龄对照组，说明6-OHDA 组阳性细胞的PCNA 表达强度弱于对照组，此结果可以解释阻断交感神经降低了两个年龄段小肠绒毛长度和V/C 的现象，说明交感神经能促进青年和老龄小鼠肠腺细胞不断增殖，有利于维持小肠正常的发育和消化吸收功能，并且对于青年小鼠的调控要强于老龄小鼠。

过量的活性氧会破坏肠黏膜的屏障，通过促进肠上皮细胞凋亡和细胞间的紧密连接而影响肠黏膜上皮细胞的完整性，从而导致肠道炎症[17]。为了探究小肠黏膜上皮细胞增殖减弱的机制，我们测定了四种重要的衡量抗氧化功能的指标，包括SOD、GSHPx、T-AOC 和MDA 活性。前两种酶均能保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。T-AOC是反应机体总抗氧化能力的酶，而MDA 的量则指示体内脂质过氧化的程度。6-OHDA 处理导致心脏中谷胱甘肽还原酶活性升高，在肺中导致谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶活性的升高[18]，可是对肾脏的抗氧化酶就没有影响，说明交感神经切除对抗氧化的影响因组织而异。我们之前对于脾脏的研究发现6-OHDA 组处理的脾脏中SOD、GSH-Px 和T-AOC 均低于对照组，而MDA 含量高于对照组，这个结果和本文对青年小鼠小肠的研究趋势是一致的。本实验化学性阻断交感神经后，在小肠组织中，青年鼠SOD 和GSH-Px 的抗氧化酶活性降低，总抗氧化酶活性也下降，但脂质氧化终产物MDA 显著增加；老龄鼠除了GSH-Px 无显著差异外，其他指标和青年鼠变化趋势一致，但变化程度略小。抗氧化能力的下降可能与本实验中小肠PCNA 表达水平减少，进而导致绒毛长度降低有关。交感神经对青年和老龄鼠的调控存在差异，与一个以前的结果相似：用β-肾上腺素能受体激动剂激活交感神经，均引起青年和老龄大鼠脾细胞中环磷酸腺苷的升高，但是来自老龄大鼠的脾细胞的增加程度低于青年大鼠[19]，说明随着年龄的增加，交感神经对肠黏膜上皮的调控趋势不变，但作用效果减弱。

综上所述，交感神经对青年和老龄鼠小肠上皮细胞增殖的调控趋势一致，但程度不一。化学性阻断交感神经，引起青年和老龄小肠组织中总抗氧化酶活性下降, MDA 含量增加，显著降低了肠道的抗氧化能力，不利于清除体内的脂质过氧化产物，可能是小肠上皮细胞PCNA 表达水平下降，增殖减慢而导致绒毛长度降低，V/C 比值下降的原因。