栀子苷对溃疡性结肠炎模型大鼠的治疗作用及其机制

步 楠 范彦秋

溃疡性结肠炎(UC)是临床常见的炎症性肠病。UC的发病机制目前仍未完全阐明，临床上也缺乏根治UC的药物。肠黏膜内慢性非特异性炎性反应的激活是UC的重要病理特征，细胞内的多种炎性信号通路在UC的发病过程中呈过度激活状态。NF-κB是Toll样受体(TRL)下游的重要转录因子，激活后转位进入细胞核并促进多种炎症基因的表达和炎性反应的激活；NOD样受体蛋白3(NLRP3)是(NLRP3)炎性小体的重要组成部分，活化后能够招募细胞内的半胱天冬酶-1(caspase-1)并使无活性的促炎细胞因子前体向有活性的促炎细胞因子成熟体转化，进而促进炎性反应的激活。现有的研究[1-3]结果表明，NF-κB通路和NLRP3炎性小体在UC肠黏膜中呈过度激活的状态。因此，抑制NF-κB通路和NLRP3炎性小体也被认为是治疗UC的潜在靶点。

栀子苷是栀子的主要活性成分，属于环烯醚萜苷类化合物，已经在类风湿关节炎、心肌梗死、脑梗死等动物模型中被证实能够发挥免疫调节、抗炎、抗氧化等生物学作用[4-6]。本研究将栀子苷用于UC模型大鼠的治疗，探讨栀子苷治疗UC的价值及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级Sprague-Dawley(SD)大鼠共60只，体重200～250 g，购自黑龙江中医药大学，许可证号SCXK(黑)2016-004，由佳木斯医学院实验动物中心饲养。

1.1.2 实验试剂 栀子苷、三硝基苯磺酸(TNBS)、NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(PDTC)、NLRP3炎性小体抑制剂VX765购自美国Sigma公司；ELISA试剂盒购自上海西唐公司，紫外线比色法试剂盒购自南京建成公司，超纯RNA提取试剂盒、SuperRTcDNA第一链合成试剂盒、UltraSYBR Mixture试剂购自北京康为世纪公司，闭锁小带蛋白-1(zonula occludens-1，ZO-1)、闭合蛋白(Occludin)、密封蛋白-1(Claudin-1)、NF-κB p65、NLRP3、caspase-1的单克隆抗体购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 分组、造模和给药 按照随机数字表将SD大鼠分为对照组、模型组、栀子苷组、PDTC组、VX765组，每组12只。模型组、栀子苷组、PDTC组、VX765组采用TNBS灌肠的方式建立UC模型：将无水乙醇与5%的TNBS按1∶1比例混合，把直径2 mm的聚乙烯管经大鼠肛门插入8 cm，按照TNBS 100 mg/kg的剂量将混合液经聚乙烯管灌入；对照组给予等剂量0.9%氯化钠溶液灌肠。灌肠后24 h，开始给药。参照Xu等[7]研究的方法，栀子苷组予栀子苷(50 mg/kg)灌胃，1次/d；PDTC组给予PDTC (5 mg/kg)腹腔内注射，1次/d；VX765组给予VX765 (50 mg/kg)腹腔内注射，1次/d。

1.2.2 体重和摄食量的观察 干预当天至干预第14天，每天称量大鼠的体重和食物质量，计算摄食量。

1.2.3 肠黏膜组织病理学评分 处死大鼠后解剖结肠组织，用4%甲醛溶液固定后常规石蜡包埋，制作石蜡切片后进行H-E染色，置于高倍光学显微镜下观察肠黏膜的组织形态并进行评分(0～5分，0分为无损伤，5分为重度糜烂、严重充血水肿。得分越高，病变越重)。

1.2.4 血清中二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸含量的测定 处死大鼠后留取外周血5 mL，静置后离心分离血清，应用紫外比色法试剂盒测定DAO含量，应用ELISA试剂盒测定D-乳酸含量。

1.2.5 细胞因子含量的测定 处死大鼠后解剖结肠组织，加入磷酸盐缓冲液后在液氮上研磨，研磨液以3 000×g离心后弃去沉淀、保留上清液，应用ELISA试剂盒测定上清液中TNF-α、IL-1、IL-18含量。

1.2.6 细胞因子mRNA表达量的测定 处死大鼠后解剖结肠组织，应用超纯RNA提取试剂盒提取组织中的RNA，应用SuperRTcDNA第一链合成试剂盒将RNA反转录为cDNA；取cDNA 1 μL、UltraSYBR Mixture试剂10 μL、0.2 μmol/L的引物混合液0.8 μL、去离子水8.2 μL混合，在荧光定量PCR仪上进行反应，得到反应曲线和相应的循环阈值(Ct)，参照公式2-△△Ct计算TNF-α、IL-1、IL-18的mRNA表达量。

1.2.7 Western印迹法检测蛋白质的表达量 处死大鼠后解剖结肠组织，用蛋白裂解液提取总蛋白质后测定总蛋白质含量，取50 μg总蛋白质进行Western印迹法检测，行SDS-PAGE和转膜，将蛋白质样本转移至硝酸纤维素(NC)膜后用5%脱脂牛奶封闭NC膜2 h，加入1∶1 000稀释的ZO-1、Occludin、Claudin-1、NF-κB p65、NLRP3、caspase-1单克隆抗体在4 ℃孵育过夜；第2天取出NC膜，用TBST缓冲液洗涤3次后孵育HRP第二抗体1 h，TBST缓冲液洗涤3次并加入显影液，在化学发光成像系统中曝光得到蛋白质条带，应用Image-J软件扫描蛋白质条带灰度值，计算ZO-1、Occludin、Claudin-1、NF-κB p65、NLRP3、caspase-1灰度值与β-actin灰度值的比值作为相应分子的蛋白质表达量。

2 结 果

2.1 各组大鼠的体重和摄食量 造模前各组大鼠的体重和摄食量的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。造模后至实验结束，对照组大鼠体重保持平稳，略有增加；摄食量逐日增加。模型组、栀子苷组、PDTC组和VX765组大鼠体重下降，摄食量增加缓慢。第6、8、14天，模型组大鼠的体重、摄食量均明显低于对照组(P值均<0.05)；第8、14天，栀子苷组、PDTC组、VX765组大鼠的体重和摄食量均明显高于模型组(P值均<0.05)。见表1。

与对照组比较，①P<0.05；与模型组比较，②P<0.05

2.2 各组大鼠肠黏膜的H-E染色和组织病理学评分 对照组、模型组、栀子苷组、PDTC组和VX765组大鼠的组织病理学评分分别为0.76±0.09、3.94±0.62、1.76±0.26、1.95±0.32、1.88±0.39，组间比较差异有统计学意义(F=19.224，P<0.01)，进一步两两比较发现，模型组明显高于对照组(P<0.05)；栀子苷组、PDTC组、VX765组大鼠的组织病理学评分均明显低于模型组(P值均<0.05)。见图1。

A 对照组 B 模型组 C 栀子苷组 D PDTC组 E VX765组图1 各组大鼠肠黏膜H-E染色比较 ×100

2.3 各组大鼠肠黏膜内炎性细胞因子的含量及其mRNA表达水平 模型组大鼠肠黏膜内TNF-α、IL-1、IL-18的蛋白质含量及其mRNA表达水平均明显高于对照组(P值均<0.05)。栀子苷组、PDTC组大鼠肠黏膜内TNF-α、IL-1、IL-18的蛋白质含量及其mRNA表达水平均明显低于模型组(P值均<0.05)；VX765组大鼠肠黏膜内TNF-α、IL-1、IL-18的蛋白质含量和TNF-α的mRNA表达水平均明显低于模型组(P值均<0.05)，IL-1、IL-18的mRNA表达水平与模型组的差异无统计学意义(P值均>0.05)。见表2。

组别TNF-α蛋白质(μg/L)mRNAIL-1蛋白质(μg/L)mRNAIL-18蛋白质(μg/L)mRNA对照2.55±0.451.00±0.14164.48±22.351.00±0.18121.37±23.411.00±0.17模型8.23±1.27①2.51±0.45①452.32±68.75①2.88±0.62①321.76±52.35①2.24±0.46①栀子苷3.88±0.62②1.67±0.27②249.95±52.23②1.78±0.28②204.56±32.4②1.50±0.24②PDTC4.13±0.59②1.52±0.19②228.74±47.51②1.61±0.22②212.52±27.58②1.46±0.19②VX7653.73±0.51②1.58±0.22②235.37±42.68②2.72±0.39201.36±32.19②2.15±0.38F16.8448.94813.74411.38218.1287.228P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

与对照组比较：①P<0.05。与模型组比较：②P<0.05

2.4 血清中DAO、D-乳酸的含量 模型组大鼠血清中DAO、D-乳酸的含量均明显高于对照组(P值均<0.05)。栀子苷组、PDTC组、VX765组大鼠血清中DAO、D-乳酸的含量均明显低于模型组(P值均<0.05)。见表3。

组别DAO(U/L)D-乳酸(mg/L)对照6.71±0.946.12±0.89模型8.94±1.25①27.62±4.42①栀子苷7.12±0.89②10.32±1.85②PDTC6.88±0.97②11.67±1.77②VX7656.96±0.87②10.16±1.46②F10.21017.169P<0.001<0.001

与对照组比较，①P<0.05；与模型组比较，②P<0.05

2.5 肠黏膜内连接蛋白的蛋白质表达量 模型组大鼠肠黏膜内ZO-1、Occludin、Claudin-1的蛋白质表达量均明显低于对照组(P值均<0.05)。栀子苷组、PDTC组、VX765组大鼠肠黏膜内ZO-1、Occludin、Claudin-1的蛋白质表达量均明显高于模型组(P值均<0.05)。见图2、表4。

2.6 肠黏膜内NF-κB通路分子和NLRP3的蛋白质表达量 模型组大鼠肠黏膜内NF-κB p65、NLRP3、caspase-1的蛋白质表达量均明显高于对照组(P值均<0.05)。栀子苷组大鼠肠黏膜内NF-κB p65、NLRP3、caspase-1的蛋白质表达量均明显低于模型组(P值均<0.05)；PDTC组肠黏膜内NF-κB p65的蛋白质表达量低于模型组(P<0.05)，NLRP3和Caspase-1的蛋白质表达量与模型组的差异均无统计学意义(P值均>0.05)；VX765组肠黏膜内NF-κB p65的蛋白表达量与模型组的差异无统计学意义 (P>0.05)， NLRP3和Caspase-1的蛋白质表达量均明显低于模型组(P值均>0.05)。见图3、表5。

1 对照组 2 模型组 3 栀子苷组 4 PDTC组 5 VX765组 A ZO-1表达 B Occludin表达 C Claudin-1表达图2 肠黏膜内ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白质表达情况

表4 各组大鼠肠黏膜内ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白质表达量的比较

与对照组比较，①P<0.05；与模型组比较，②P<0.05

1 对照组 2 模型组 3 栀子苷组 4 PDTC组 5 VX765组 A NF-κB蛋白质表达 B NLRP3蛋白质表达 C caspase-1蛋白质表达图3 肠黏膜内NF-κB p65、NLRP3、caspase-1蛋白质表达情况

组别NF-κB p65NLRP3caspase-1对照1.00±0.241.00±0.251.00±0.28模型2.25±0.42①3.41±0.62①4.22±0.62①栀子苷1.56±0.25②2.58±0.52②2.11±0.32②PDTC1.42±0.25②3.32±0.523.89±0.62VX7652.31±0.452.77±0.46②2.26±0.52②F12.87518.92823.482P<0.001<0.001<0.001

与对照组比较，①P<0.05；与模型组比较，②P<0.05

3 讨 论

UC是与自身免疫应答紊乱相关的非特异性炎症性肠病，肠黏膜内炎性反应的持续激活是疾病主要的病理特征[8-9]。目前，临床上仍缺乏根治UC的有效药物，肠黏膜炎性反应激活所引起的临床症状会反复发生。栀子苷是从栀子中提取得到的环烯醚萜苷类化合物，具有免疫调节、抗炎、抗氧化等生物学作用。在自身免疫性疾病类风湿关节炎的动物模型中，栀子苷被证实能够调节免疫功能，改善病情[10]。为了明确栀子苷治疗UC的价值，本研究首先通过TNBS灌肠的方式建立了UC大鼠模型，发现模型组大鼠的肠黏膜发生了明显损害，损伤程度和病变范围均达到了3～4分，且模型组大鼠的体重和摄食量均明显低于对照组，提示TNBS灌肠成功建立了UC大鼠模型。在TNBS造模的基础上，予大鼠栀子苷灌胃干预后发现，栀子苷组大鼠的组织病理学评分明显低于模型组，体重和摄食量均明显高于模型组；提示栀子苷治疗能够减轻UC模型大鼠的肠黏膜损害，改善UC模型大鼠的体重和摄食情况，在UC的治疗中发挥了积极的作用。

肠黏膜内慢性炎性反应的持续激活是UC重要的病理表现，炎性细胞因子的高表达和大量释放是炎性反应激活的特征。TNF-α、IL-1、IL-18是具有强大促炎活性的细胞因子，由单核巨噬细胞、淋巴细胞等分泌，能够在肠黏膜内介导炎性反应的级联放大并引起肠黏膜病理损害[11-12]。本研究结果显示：模型组大鼠肠黏膜内TNF-α、IL-1、IL-18的蛋白质及其mRNA表达量均明显高于对照组，栀子苷组大鼠肠黏膜内TNF-α、IL-1、IL-18的蛋白质及其mRNA表达量均明显低于模型组。提示UC模型大鼠肠黏膜内多种炎性细胞因子大量表达和分泌，栀子苷能有效抑制UC模型大鼠肠黏膜内炎性细胞因子的表达和分泌，具有抑炎活性。慢性炎性反应会直接造成肠黏膜屏障损伤，肠黏膜上皮细胞内的DAO大量释放进入血液循环，肠道菌群也发生易位并产生大量D-乳酸进入血液循环[13]，参与肠黏膜上皮间紧密连接的蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1等表达受到抑制[14-15]。本研究对上述肠黏膜屏障功能相关指标的分析显示：模型组大鼠血清中DAO和D-乳酸的含量均明显高于对照组，肠黏膜内ZO-1、Occludin、Claudin-1的表达均明显低于对照组；而栀子苷组大鼠血清中DAO和D-乳酸的含量明显低于模型组，肠黏膜内ZO-1、Occludin、Claudin-1的表达明显高于模型组。这一结果表明UC模型大鼠的肠黏膜屏障受损，栀子苷能够减轻UC模型大鼠肠黏膜的受损程度。

NF-κB通路和NLRP3炎性小体是细胞内调控炎性反应的重要机制。在生理条件下，NF-κB与相应的抑制分子(IκB)结合并处于无活性状态；在外界病理因素的刺激下，细胞外信号向细胞内传递引起NF-κB与IκB解离并发生活化。活化的NF-κB向细胞核内转移后能够结合TNF-α、IL-1、IL-18基因的启动子区域，进而通过基因表达产物来介导炎性反应[16-17]。本研究对肠黏膜内NF-κB表达的分析显示：模型组大鼠肠黏膜内NF-κB的表达水平明显高于对照组，栀子苷组大鼠肠黏膜内NF-κB的表达水平明显低于模型组，提示肠黏膜内NF-κB的表达在UC发病过程中明显增多，栀子苷干预能够通过抑制肠黏膜内NF-κB的活化，到抑炎作用。为了进一步验证NF-κB在UC发病及其在栀子苷治疗中的作用，本研究使用NF-κB的抑制剂PDTC干预UC模型大鼠，观察到PDTC组大鼠的组织病理学评分，肠黏膜内TNF-α、IL-1、IL-18的蛋白质及其mRNA表达量，血清中DAO、D-乳酸的含量均明显低于模型组，体重，摄食量，肠黏膜内ZO-1、Occludin、Claudin-1的蛋白质表达水平均明显高于模型组，而与栀子苷组的差异无统计学意义。这一结果表明NF-κB抑制剂能够减轻UC模型大鼠肠黏膜损伤，降低多种炎性细胞因子的表达和分泌。

NF-κB进入细胞核后调节TNF-α、IL-1、IL-18的表达，TNF-α基因的表达产物能够直接发挥促炎作用，而IL-1、IL-18基因的表达产物为无活性前体，需要在NLRP3炎性小体的进一步介导下裂解为有活性的成熟体并发挥促炎作用。caspase-1亦是NLRP3炎性小体的重要组成部分，NLRP3表达的上调能够活化caspase-1，活化的caspase-1将IL-1和IL-18的无活性前体裂解为有促炎活性的成熟体，进而介导炎性反应[18-19]。本研究对NLRP3炎性小体表达的分析显示：模型组大鼠肠黏膜内NLRP3、caspase-1的表达水平均明显高于对照组，栀子苷组大鼠肠黏膜内NLRP3、caspase-1的表达水平均明显低于模型组，提示肠黏膜内NLRP3炎性小体的表达在UC发病过程中明显增多，栀子苷能够降低肠黏膜内NLRP3炎性小体，发挥抑炎作用，提示栀子苷能够通过抑制NLRP3炎性小体的表达来发挥对UC模型大鼠的治疗作用。使用NLRP3炎性小体的抑制剂VX765干预后，VX765组大鼠的组织病理学评分，肠黏膜内TNF-α的含量及其mRNA表达量，IL-1、IL-18的含量，血清中DAO、D-乳酸的含量均明显低于模型组，体重，摄食量，肠黏膜内ZO-1、Occludin、Claudin-1的蛋白质表达量均明显高于模型组，而IL-1、IL-18的mRNA表达量与模型组的差异无统计学意义。这一结果表明，NLRP3炎性小体抑制剂够减轻UC模型大鼠肠黏膜损伤，降低血清IL-1、IL-18水平，但不影响IL-1β、IL-18的mRNA转录水平，说明该抑制剂有效抑制了IL-1β和IL-18前体裂解为IL-1β、IL-18的过程。证明了NLRP3炎性小体的生物学功能为调控IL-1、IL-18前体的裂解而非调控IL-1β、IL-18的基因编码。

综上所述，UC大鼠肠黏膜内NF-κB通路和NLRP3炎性小体的过度激活介导了炎性反应的激活，栀子苷能够通过抑制NF-κB通路和NLRP3炎性小体所介导的炎性反应来发挥治疗UC的价值。尽管本实验已经明确了栀子苷用于UC治疗的价值及其相关分子机制，但进一步需要解决的问题是栀子苷与传统UC治疗药物柳氮磺胺吡啶是否存在协同作用。为此，本课题组计划在下一步实验中设计栀子苷联合柳氮磺胺吡啶的干预组，分析联合给药与单独给药治疗UC效果的差异，旨在为临床推广栀子苷治疗提供更为确切的依据。