长链非编码RNA调控肝癌发生发展相关细胞信号通路的研究进展

唐佳月 林 勇

高通量RNA测序技术的发展使得大量长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)基因被发现。既往认知中，大多数lncRNA是没有任何功能的随机转录产物；然而近年来越来越多的证据表明，lncRNA参与诸多病理生理过程，是细胞中重要的功能分子。以下对肝癌相关lncRNA的功能和分子机制进行概述，探讨lncRNA在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中Wnt、信号转导与转录活化因子3(STAT3)、上皮间质转化(epithelial-mesenchymal tramsition，EMT)、NF-κB这4种细胞信号通路发挥的重要调控作用。了解lncRNA在肝癌发生中发挥作用的途径，以期为肝癌的临床诊断和治疗提供帮助。

1 lncRNA功能概述

非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)以200个碱基为限分为短链非编码RNA和lncRNA两大类，两者的共同特点为均无蛋白质编码能力[1]。与作为蛋白质合成模板的mRNA相似，lncRNA的作用发挥需经过剪接、5’帽子、聚腺苷酸化、RNA编辑等RNA加工步骤，在肿瘤和胚胎发育中具备差异调控的特点。不同细胞成分的lncRNA通常发挥不同的生物学功能。细胞核中lncRNA可作为染色质修饰复合体[2]或转录因子的向导[3]来发挥作用；细胞质中的lncRNA则多在蛋白质水平进行调控，通过直接调节mRNA稳定性[4]或作为竞争内源性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)成为微RNA(micro RNA, miRNA)的海绵分子，吸附相关miRNA并调控其下游信号通路[5]。

已有研究[1]结果表明，lncRNA在HCC的发生、转移、侵袭过程中发挥重要作用。根据在肿瘤发生和发展过程中的生物学功能，以及正向或负向调控作用，lncRNA可分为致癌lncRNA和抑癌lncRNA，分别通过调控Wnt、STAT3、EMT等肿瘤相关信号通路发挥促癌或抑癌作用。

2 不同信号通路相关lncRNA

2.1 Wnt信号通路相关lncRNA Wnt信号通路是肝癌发生和发展中的关键信号通路之一。该通路在进化上高度保守，在HCC发生和发展过程中被激活并决定细胞命运[6]。Wnt信号通路激活的过程由WNT5A等可溶性Wnt蛋白启动，上述蛋白质与Frizzled家族的膜结合G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor, GPCR)结合后，导致由轴蛋白(AXIN)、结肠腺瘤性息肉病基因蛋白(APC)、蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)、糖原合成酶激酶3(glycogenkinase 3，GSK3)和酪蛋白激酶1α(casein kinase 1α，CK1α)组成的破坏复合体失活，对β-连环蛋白(β-catenin)靶向泛素化的作用消失，β-catenin降解减少，在细胞质中沉积增多并转位至细胞核，随后作为转录因子T淋巴细胞因子(T-cell factor，TCF)/淋巴增强因子(lymphoid enhancer factor，LEF)的反式作用因子激活下游靶基因的转录[7]。β-catenin由CTNNB1基因编码，而CTNNB1、AXIN1、APC均是HCC中突变频繁的蛋白质编码基因，CTNNB1基因突变最常发生于对β-catenin降解起重要作用的结构域，可导致β-catenin的聚集；AXIN1基因突变可使AXIN1失活，破坏复合体的活性，从而导致β-catenin活性增高[8-9]。此外，GSK3和CK1α功能受到抑制也可引起细胞质中β-catenin增多。

lncRNA可通过调控CTNNB1、APC、GSK3等多个Wnt通路重要靶点在HCC的发生和发展中发挥作用(图1)。抗分化lncRNA(lncRNA-DANCR)、泛素折叠修饰结合酶1相关lncRNA(lnc-UFC1)、β-catenin相关lncRNA(lnc-beta-catm)均在HCC细胞中高表达，提示预后不良[10-13]；它们的共同特点是均作用在β-catenin环节。在HCC细胞中过表达lncRNA-DANCR可提高成瘤能力，促进其在小鼠肝脏和肺中定植；其促癌的作用主要通过竞争性结合miRNA-214、miRNA-320a、miRNA-199a，阻断上述miRNA对CTNNB1基因的沉默作用，导致CTNNB1蛋白质水平升高，进而激活Wnt信号通路[10]。lnc-UFC1对CTNNB1蛋白质的调控作用则通过募集RNA结合蛋白(RNA binding protein，RBP)至CTNNB1 mRNA，防止其发生降解；此外，lnc-UFC1还可促进CTNNB1蛋白质由细胞质向细胞核易位[11]。与前述两个lncRNA不同，lnc-beta-catm在HCC中的作用机制是稳定CTNNB1蛋白。lnc-beta-catm与组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶(enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit，EZH2)结合，将其募集至CTNNB1并甲基化CTNNB1蛋白的赖氨酸残基，通过含E3泛素蛋白连接酶的β-转导素重复序列(beta-transducin repeat containing E3 ubiquitin protein ligase,BTRC)抑制其泛素化，从而激活Wnt通路[12]。

图1 HCC中lncRNA对Wnt信号通路的调控作用

Wnt信号途径激活lncRNA(lnc-TCF7)和结肠腺瘤性息肉病基因相关lncRNA(lnc-APC)的作用靶点分别为TCF7和APC。lnc-TCF7是一种在肝肿瘤干细胞(cancer stem cell, CSC)中高表达的lncRNA。其与转录因子7(transcription factor 7，TCF7)启动子区域的DNA结合，招募染色质重建复合体SWI/SNF(Yeast mating-type switching/sucrose non-fermenting)至TCF7启动子中，触发TCF7表达，促进Wnt通路下游基因活性[2]。lnc-APC在肝肿瘤起始细胞(TIC)中高表达、过表达或沉默lnc-APC可促进或抑制TIC成瘤能力；其作用机制为招募EZH2至APC启动子，抑制APC的转录[10]。

GSK3也是lncRNA在Wnt信号通路的重要元件，lncRNA-核内小RNA宿主基因5(lnc-SNHG5)、lncRNA-间充质干细胞上调因子(lnc-MUF)均作用于该靶点。lnc-SNHG5在HCC中高表达，与HCC预后呈正相关，可判断治疗效果。上调SNHG5可抑制肝癌细胞凋亡，促进肝癌细胞增殖、侵袭和迁移；下调SNHG5可诱导肝癌细胞凋亡，抑制肝癌细胞的增殖和转移。SNHG5的作用机制：作为ceRNA竞争性结合miRNA-26a-5p调控GSK 3β的表达，并激活Wnt信号通路，诱导EMT[14]。lnc-MUF可促进肝癌细胞成瘤和侵袭能力。其作用机制：与Wnt通路上游元件膜联蛋白A2(ANXA2)相互作用，阻碍GSK 3β/CTNNB1复合体形成，促进CTNNB1蛋白质蓄积。此外，lnc-MUF还可作为miRNA-34a的ceRNA，调节转录因子SNAIL1活性[15]。

2.2 STAT3信号通路相关lncRNA Janus激酶(JAK)-STAT信号通路与肝癌的发生和发展密切相关。该通路由IL-6家族细胞因子受体、GPCR或toll样受体(TLR)等诱导。各种原因导致JAK2激活后，磷酸化STAT3形成功能活性二聚体，转位至细胞核，可引起促生存基因、炎性反应因子相关基因、EMT和CSC相关基因的转录增加[16]。在JAK-STAT通路中，STAT3相关ncRNA最多，与lncRNA相关性也最为密切[17]。STAT3可调控许多直接参与HCC进展及其早期阶段的基因[18-19]。

作用于STAT3信号通路的促癌lncRNA包括lncRNA-SRY盒转录因子4(lnc-Sox4)、转化生长因子β活化的lncRNA(lnc-ATB)、lncRNA-尿路上皮癌相关基因1(lnc-UCA1)等，抑癌lncRNA则包括肝肿瘤干细胞中下调的lncRNA(lncRNA-DILC)等。lnc-Sox4可直接与STAT3结合，将STAT3招募至SOX4的启动子区域，从而驱动SOX4及其下游基因表达[3]。lnc-ATB通过RNA-双链形成机制与IL-11 mRNA相结合，增加IL-11 mRNA的稳定性，促进IL-11自分泌，激活IL 11/STAT3信号通路，经不依赖于EMT的途径增强HCC的定植能力[4]。lnc-UCA1可激活NF-κB/STAT3信号，促进肝肿瘤细胞恶性转化和增强其增殖的能力[20]。而lncRNA-DILC是一种与HCC早期复发和生存时间缩短相关的抑癌lncRNA，抑制lncRNA-DILC显著增强肝CSC的扩增，促进肝癌发生和发展；而外源表达DILC可显著抑制该过程。lncRNA-DILC的抑癌作用是通过干扰NF-κB介导的IL-6表达，从而抑制IL-6/STAT3自分泌信号实现[21]。

2.3 调控EMT的lncRNA EMT是指在生理或病理情况下，上皮细胞失去极性，黏附能力降低，而迁移、侵袭能力增强，逐渐转变为间充质细胞的过程。其特征为Snail家族转录抑制因子1(SNAI1)、Twist和E盒结合锌指蛋白(ZEB)1/2等转录因子活化，波形蛋白(vimentin, Vim)、N-钙黏蛋白等间质相关蛋白质的表达上调，E-钙黏蛋白等细胞间连接蛋白的蛋白质表达下调[22]。HCC细胞的侵袭性、移行性与EMT密切相关，是HCC转移和侵袭发生的重要机制[23]。

lncRNA调控EMT信号通路主要是作为EMT关键元件相关miRNA的ceRNA或调控EMT相关转录因子活化实现。有研究[24]结果表明，缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF1α)与EMT直接相关，并通过肿瘤血管的形成间接参与肿瘤的转移过程。通过作用于HIF1α调控EMT的lncRNA包括重编程调控lncRNA(lnc-ROR)、肿瘤低表达lncRNA(lnc-LET)、CPS1内含子转录本1(CPS1-IT)等。其中lnc-ROR为促癌lncRNA，lnc-LET、CPS1-IT为抑癌lncRNA。lnc-ROR是一种应激反应性lncRNA，在HCC组织中的表达上调，尤其在缺氧条件下HCC来源的细胞外囊泡内高度富集。下调lnc-ROR可升高miRNA-145表达水平，降低HIF1α表达水平，抑制EMT和肿瘤细胞活力[25]。lnc-LET在HCC组织中的表达明显下调，与IL增强剂结合因子3(ILF3)/核因子90(NF90)结合并导致其降解，负向调控HIF1α信号，抑制HCC转移[26]。CPS1-IT也是HCC组织中表达下调的lncRNA。其作用机制为影响热休克蛋白90(heat shock protein, HSP90)和HIF1α复合物的形成，降低HIF1α活性，导致重要的间质细胞标志物Vim、SNAI1、TWIST表达下调，抑制EMT[27]。

肝癌高表达lncRNA(lnc-HULC)、lnc-ATB、lncRNA-牛磺酸上调基因1(lnc-TUG1)、位于ZEB1反义链的lncRNA(lnc-ZEB1-AS1)在EMT通路中的作用靶点均为ZEB1。lnc-HULC和lnc-ATB可作为ZEB1上游miRNA-200a的ceRNA，lnc-TUG1可作为ZEB1上游miRNA-142-3p的ceRNA发挥作用；而lnc-ZEB1-AS1则直接影响ZEB1转录。lnc-HULC是较早在HCC中发现的一种促癌lncRNA，在HCC中高表达。lnc-HULC可竞争结合miRNA-200a，激活miRNA-200a靶基因ZEB1，诱导EMT，进而促进肿瘤的发展和转移；下调HCC细胞和组织中的lnc-HULC，可显著增高miRNA-200a的表达水平，降低ZEB1 mRNA表达水平，抑制EMT进程[28]。lnc-ATB在HCC和门静脉癌栓(PVTT)中的表达上调；下调lnc-ATB后，可使miRNA-200a表达水平升高，ZEB1表达水平降低，抑制HCC发生转移[12，29]。在HCC组织中，lnc-TUG1水平与miRNA-142-3p水平呈负相关，下调TUG1可显著降低ZEB1和EMT相关蛋白的蛋白质表达水平，抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力[30]。lnc-ZEB1-AS1与HCC的转移相关，在转移性肝癌组织中lnc-ZEB1-AS1高表达。该lncRNA与ZEB1共享一个双向启动子，可正向调控ZEB1表达，促进EMT和HCC转移[31]。超级增强子相关lncRNA(lnc-HCCL5)是一种超级增强子驱动的细胞质lncRNA，在HCC组织中上调，可与ZEB1形成正反馈，促进SNAI1、Slug和Twist1等间质标志物表达，加速HCC细胞的EMT进程[32]。

2.4 NF-κB信号通路相关lncRNA NF-κB通路是一个以基因转录调节为导向的生物学通路。在正常机体中，NF-κB与p50/p65形成二聚体并与NF-κB抑制蛋白(inhibitor proteins of NF-κB, IκB)相结合，以静息状态存在于细胞质中。当受到IL-6、IL-1、TNF-α等细胞因子的刺激时，通过IκB激酶的诱导，NF-κB二聚体被释放并进入细胞核，激活肿瘤侵袭、转移等相关基因转录。

lncRNA人肺腺癌转移相关转录本1(lnc-MALAT1)在HCC的肿瘤组织中上调。在脂多糖(LPS)刺激下，MALAT1下调，抑制HCC细胞的增殖和侵袭；敲除MALAT1可显著抑制LPS诱导的促炎介质IL-6和IL-8在HCC细胞中的表达，而过表达MALAT1可使其恢复。关于机制研究[33]的结果表明，MALAT1招募Brahma相关基因1(BRG1)至IL-6和IL-8启动子区，从而促进NF-κB诱导炎性因子的表达。有研究[34]发现，MALAT可作为miRNA-195的ceRNA，进而调控其下游磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinases,PI3K)/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(protein-serine-threonine kinase,AKT)和JAK/STAT通路。上述结果提示，lncRNA可能通过多种途径和功能调控HCC的发展进程。lncRNA 00607在HCC组织中的表达水平下调，其低表达预示着HCC患者的预后较差。lncRNA 00607调控HCC的机制为结合p65启动子区域，抑制p65转录，从而升高p53水平。因此，靶向TNF-α/IL-6-lncRNA 00607-NF-κBp65/p53信号通路可能是HCC化学治疗的新途径[35]。

3 lncRNA在HCC诊断和治疗中的价值

一项包含16篇研究共4 842例样本的meta分析评估了lncRNA在HCC中的诊断价值。该研究[36]中，lncRNA诊断HCC的合并灵敏度、特异度分别为87.0%和82.9%，AUC为0.915；研究结果提示，一些异常表达的lncRNA，尤其是血清和血浆中的多种lncRNA可作为潜在的标志物，在HCC中具有较高的诊断准确性，而不同标志物的联合检测可进一步提高HCC的诊断准确性。

大量研究结果表明，lncRNA在预测HCC肿瘤复发和患者生存期中发挥重要作用，生存分析显示lncRNA-DANCR、lnc-UFC1、lnc-SNHG5、lncRNA-DILC的表达水平与复发时间和总生存期显著相关，也是HCC患者复发和生存的独立危险因素，提示lncRNA可能具有判断HCC患者预后的潜能。

靶向特定lncRNA进行针对性的增强或阻断是HCC治疗一个具有潜力的新领域，已受到人们的重视，目前有研究提示lncRNA可作为靶向药物治疗HCC，如HCC组织中lnc-MALAT1的表达水平升高，沉默lnc-MALAT1可抑制HCC异种移植物的生长，并相应地抑制促炎因子在HCC组织中的表达，提示MALAT1靶向治疗可能是HCC可探索的一种临床治疗方法[33]。然而，将lncRNA作为靶向药物治疗HCC尚不成熟，仅限于理论研究阶段，仍需进一步临床试验证实lncRNA可作为HCC治疗的靶点。耐药是HCC临床治疗中最棘手的问题之一，lncRNA可作为克服耐药性的潜在靶点而在HCC治疗中发挥作用。lncRNA 00607在HCC中表达下调，其过表达可降低体内和体外HCC细胞的增殖，增强细胞凋亡，提高对INF-α、5-氟尿嘧啶(5-FU)和阿霉素治疗敏感性[35]。上述研究结果提示，lncRNA联合化学治疗可能是治疗晚期HCC的有效策略。

4 小结和展望

lncRNA通过多种方式调控Wnt、STAT3和EMT相关信号通路，参与HCC的发生、转移和侵袭过程。随着对lncRNA认识的加深，更多lncRNA调控HCC相关信号通路的研究将会促进对肿瘤发生机制研究的深化，同时可能为肿瘤的防治提供新方法。