维生素C对PM2.5所致大鼠氧化损伤的影响

韩书芝 李海月 梁会朋 张凤蕊 平芬

1河北省人民医院老年病三科，石家庄050051；2承德医学院附属医院呼吸科067000；3河北省胸科医院结核科，石家庄050048

PM2.5(fine particulate matter 2.5)是指大气中直径≤2.5μm的颗粒物，由微小的固体颗粒和液滴悬浮在空气中混合而成，与较大的大气颗粒物相比，PM2.5粒径小，富含大量的有毒、有害物质且在大气中的停留时间长、输送距离远，因而对人体健康和大气环境质量的影响更大。PM2.5的不利影响首先表现在呼吸系统，经呼吸道吸入后，可以到达肺泡并通过气血交换进入血液，引起肺组织及全身系统损伤。研究表明，PM2.5通过损伤呼吸道黏膜上皮细胞，部分沉积在肺泡内或肺间质内，激活肺内的免疫细胞，引起气道炎性反应，导致呼吸系统疾病[1]。PM2.5会增加哮喘加重及呼吸道感染、肺结核、肺癌等呼吸系统疾病的发病率[2]。

本研究采集本地区大气细颗粒物，制备PM2.5悬液，观察PM2.5暴露及维生素C干预后大鼠血清中血清丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2 deoxyguanosine，8-OHd G)、高同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)水平的变化，探讨PM2.5氧化损伤作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠32只，体质量150～200 g，均购自河北医科大学实验动物中心，饲养于河北省人民医院动物房。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组 健康雄性Wistar大鼠32只，在动物饲养室内适应性喂养一周，自由进食、饮水，饲养温度为22～24℃，湿度为45%～55%，昼夜节律为12 h。

随机数字表法随机分为4组：①空白对照组(C组，n=8)，不予处理；②生理盐水对照组(NS组，n=8)，给予气管插管滴生理盐水1 ml/kg，每周1次，共4次；③PM2.5染毒组(PM2.5组，n=8)，给予气管插管滴PM2.5(提前用生理盐水配成7.5 g/L)1 ml/kg，每周1次，共4次；④维生素C组(VC组，n=8)，染毒同PM2.5组，实验开始后给予10 ml/kg维生素C(用蒸馏水配成10 g/L)灌胃，1次/d，共四周。4组动物均自由进食水，于最后一次染毒24 h后处死动物，取材检测。

10%水合氯醛腹腔注射麻醉，抽取5 ml腹主动脉血后处死。取右下肺组织，甲醛固定，常规石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察组织病变。血清-80℃保存待测。

1.2.2 血清MDA、8-OHd G、Hcy水平的测定采用硫代巴比妥酸法测定血清MDA水平，采用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法测定血清8-OHd G、Hcy水平，操作严格按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.3 统计学分析 应用SPSS软件21.0版软件进行统计学分析，结果以±s表示，多组比较用单因素方差分析，两两比较用LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织病理学评价 光镜下观察，空白对照组及生理盐水对照组大鼠肺泡分布较均匀，结构完整，未见明显炎症细胞浸润，肺泡间毛细血管无扩张充血，无间质水肿。PM2.5染毒组：大量肺泡间隔断裂，可见明显间质水肿，毛细血管管壁扩张，血管腔及小气道内大量炎性细胞浸润，肺泡腔内可见出血。维生素C组：大鼠肺组织病理改变较PM2.5染毒组大鼠明显减轻，见图1。

2.2 大鼠血清中各指标含量的变化 空白对照组与生理盐水对照组大鼠血清中MDA、8-OHd G、Hcy差异无统计学意义。PM2.5染毒后血清中MDA、8-OHdG、Hcy水平升高，维生素C干预组MDA、8-OHdG、Hcy水平较PM2.5染毒组低，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1 各组大鼠血清MDA、8-OHdG、Hcy水平的比较(±s)

表1 各组大鼠血清MDA、8-OHdG、Hcy水平的比较(±s)

注：C为正常对照组；NS为生理盐水组；VC为维生素C组；PM为PM2.5组；与C比较，a P＜0.05，与NS比较，b P＜0.05，与VC比较，c P＜0.05

组别只数MDA(μmol/L)8-OHd G(μg/L)Hcy(mg/L)C 8 0.38±0.11 18.59±2.77 38.57±2.50 NS 8 0.44±0.14 20.32±2.00 40.09±3.53 VC 8 0.52±0.15a 21.16±1.53a 38.25±4.44a PM 8 0.67±0.13abc 26.73±2.81abc 43.87±3.08abc F值3.87 11.74 6.38 P值0.06 0.00 0.04

图1 Wistar大鼠肺组织切片 HE ×200 A：正常对照组；B：生理盐水组；C：PM2.5组；D：维生素C干预组

3 讨论

随着现代工业的发展，人类的生产、生活方式也发生了极大的变化，伴随而来的污染问题也给人们的生命健康带来巨大影响。空气污染就是危害人类健康的主要影响因素之一，其中PM2.5已成为评价大气污染的标志性污染物，已被公认为是代表性最强、危害最大的污染物，对公众的生产、生活和健康均构成严重威胁[3]。目前，我国大气PM2.5的主要来源为汽车尾气和煤炭燃烧，主要成分有碳、有机碳化合物、硫酸盐、硝酸盐、铵盐，其他的常见成分包括各种重金属元素。近年来越来越多的流行病学、毒理学资料研究已证实大气颗粒物尤其是直径小于或等于2.5μm的颗粒物，与居民死亡和发病率的增加有关，能引起哮喘、肺功能下降、呼吸系统炎症、甚至累及心血管系统、神经系统、免疫系统、促使癌症发生，具体表现为可以导致慢性病和重病患者病死率增加，肺功能和结构发生改变，免疫系统功能下降，导致心血管系统发病率和病死率增加等[4]。

目前认为PM2.5所致肺损伤的主要机制：氧化应激、炎症损伤、免疫损伤。各个机制之间并不是完全独立存在的，氧化应激可导致炎性损伤，炎性损伤也可导致体内氧化/抗氧化平衡失调。

PM2.5长期吸入可以导致气道上皮纤毛粘连、紊乱、倒伏和缺失；影响杯状细胞和浆液细胞的分泌功能[5]；支气管上皮细胞变性坏死，细支气管壁增厚，大量炎症细胞浸润[6]。PM2.5随空气到达肺泡时被巨噬细胞吞噬，此过程可诱导大量促炎性因子释放，破坏细胞因子网络平衡，从而调节和始动肺局部炎症反应，诱导肺部炎性损伤[7]。本组实验结果提示：给大鼠气管滴入PM2.5染毒后，肺组织切片可见到大量肺泡间隔断裂，间质水肿，毛细血管扩张，支气管壁、血管腔及小气道内大量单核细胞，淋巴细胞和中性粒细胞等炎性细胞浸润，肺泡腔内可见出血。与上述研究结果相一致。

PM2.5介导的炎性细胞激活能够引起活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)和活性氮分子产生增加，诱导氧化应激的发生；另一方面，PM2.5可通过各种机制损害受刺激细胞的抗氧化系统并降低其抗氧化能力。有研究发现PM2.5暴露产生的ROS作为功能性信号分子，触发核转录因子Nrf2易位到细胞核，从而导致抗氧化酶系统转录变更，可引起抗氧化酶表达改变并降低其活性。此外，PM2.5暴露产生的ROS可通过损害血脂、蛋白质和DNA等大分子的结构和功能导致靶细胞和组织的损害。

MDA是自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应在机体内形成脂质过氧化物的最终降解产物。MDA含量的变化反映了体内脂质过氧化的严重程度。本组实验结果显示PM2.5可导致大鼠血清MDA含量升高，给予维生素C灌胃，血清MDA含量无明显升高，提示PM2.5染毒后存在脂质过氧化反应，维生素C具有保护作用。8-OHdG是ROS致DNA氧化损伤的产物，实验中常用作检测氧化损伤、DNA突变的标志物。活性氧自由基如羟自由基、超氧阴离子等攻击DNA分子中的鸟嘌呤碱基第8位碳原子时，可生成氧化性加合物8-OHdG，从而使DNA链空间结构改变。这种突变难以修复或修复极慢，是活性氧引起突变、诱发癌症过程中的重要事件[8]。本组实验结果显示PM2.5染毒可导致大鼠血清8-OHdG含量升高，给予维生素C灌胃，血清8-OHdG无明显升高。提示PM2.5染毒后存在DNA氧化损伤，维生素C可拮抗这种损伤。Hcy是一种含硫氨基酸，是甲硫氨基酸的中间产物，PM2.5进入机体可导致体内氧化应激增强，甲硫氨酸合成酶减少，Hcy代谢途径受损，在体内积聚释放至血液中[9]。Hcy代谢过程中产生大量氧化物质，其本身可干扰谷胱甘肽合成，Hcy可作为氧化剂加重肺损伤。同时，Hcy巯基氧化后超氧化物和过氧化氢的增多可引起脑组织氧化损伤[10]。实验中观察到PM2.5染毒可导致大鼠血清Hcy含量的升高，给予维生素C灌胃后血清Hcy含量无明显升高。

实验结果提示，PM2.5染毒可导致氧化损伤，维生素C对PM2.5所致的氧化损伤有一定的保护作用，其确切机制有待进一步研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突