坏死性凋亡与肿瘤治疗

张梦然，刘金梅，弓建华，刘秀均



坏死性凋亡与肿瘤治疗

张梦然，刘金梅，弓建华，刘秀均

100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所肿瘤室（张梦然、弓建华、刘秀均）；250022 济南，山东特殊教育职业学院（刘金梅）

在多细胞生物个体中，细胞增殖和死亡之间的动态平衡是维持生物体内环境稳态的必要条件，也是生物体生长发育的重要条件之一。当体内细胞过度增殖或细胞正常死亡受到抑制时，恶性肿瘤的发生率大大增加。因此，有研究者认为，恶性肿瘤的两大显著特征为细胞无限增殖和死亡抑制[1]。在传统意义上，人们将细胞的死亡分为调控型和非调控型两类。然而，近年来研究发现，细胞坏死也可以像细胞凋亡一样受到遗传物质的调控，这是一种新型的细胞死亡机制。因其由基因控制但细胞形态表现为细胞坏死，所以又称为坏死性凋亡，并且其调控过程不经含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）介导。大量的研究证明，坏死性凋亡或程序性坏死在恶性肿瘤的发生、发展、侵袭、转移以及耐药中发挥着重要的作用。本文将对坏死性凋亡机制及其有别于凋亡、坏死等的特点，在肿瘤治疗中的潜在应用等做简单阐述，以期为肿瘤治疗提供新靶点、新思路。

1 坏死性凋亡是一种重要的细胞死亡形式

随着研究的深入，越来越多的细胞死亡方式被发现和命名，例如凋亡、坏死、自噬、裂亡、胀亡、类凋亡、铁凋亡及坏死性凋亡等[2]。凋亡和坏死是人们认识最早也是最经典的两种细胞死亡方式。前者作为一种由遗传基因控制的细胞自主、有序的死亡方式，不仅是生物体内绝大多数细胞在特定的生长发育阶段都会发生的现象，而且是生物体内细胞保持正常活性和功能必不可少的过程。与凋亡不同的是，坏死一般情况下被认为是非可控的，是从形态学上的特点来定义的一种死亡方式。外界抑制因素过强可直接引起坏死，是一种受环境影响的细胞被动死亡。然而，近年来的研究表明，细胞坏死也可以受到细胞内信号传导通路调控，它可以不经 caspase 介导，因此在凋亡通路被抑制时仍然可以发挥作用，其细胞形态学表现与常规坏死一致。2005 年，Degterev等[3]首次发现并命名了受调节的坏死。这其中包含多种方式，如继发性坏死、自死亡、铁凋亡、细胞焦亡、PARP-1 依赖性细胞死亡、坏死性凋亡、亲环素坏死等。其具有坏死的形态学特征，如细胞核碎裂、细胞和细胞器肿胀以及细胞质膜破裂等。

越来越多的研究表明，坏死性凋亡是一种重要的细胞死亡机制。在许多免疫系统疾病、慢性肾脏病、脑缺血、心肌缺血、急性和慢性神经退行性疾病、肿瘤等多种人类病理活动中具有重要作用[4-5]。

2 坏死性凋亡的胞内分子机制

细胞的坏死性凋亡是一个机体主动的、依赖细胞内信号转导的过程，由相应配体通过激活死亡受体而触发。与 Fas 蛋白的死亡结构域相似，这一细胞内的结构域是种附属信号蛋白的结合位点，这些蛋白包括 Fas 相关死亡区段结合蛋白（FADD）、TNFR-1 相关死亡区段结合蛋白（TRADD）和 TNFR 相关因子 2（TRAF2）。其中，细胞内 caspase 活性是否受到抑制是坏死性凋亡能否被完全激活的关键因素。

2.1 坏死性凋亡的上游信号

坏死性凋亡与凋亡有着共同的上游信号元件，其中研究最多最深入的是肿瘤坏死因子受体 1（TNFR1，又称作 p60、p55、CD120a）。TNFR1 又称为肿瘤坏死因子受体超家族成员 1A（TNFRSF 1A），是一种普遍存在的膜受体，属于死亡受体的一种。死亡受体是在细胞膜表面发现的一组细胞表面标记，是指在肿瘤坏死因子受体超家族中含有死亡结构域的成员，例如 TNFR1、Fas 受体 DR4 和DR5[6]，与相应的配体结合后，可以通过自身结构的变化，将胞外信号向细胞内部传递。TNFR1 上面的死亡结构域是一段约 70 个氨基酸的序列，这对于 TNF-α 启动细胞凋亡是必需的。此外 TNFR1 还可以与衔接蛋白 TNF 受体相关的死亡结构域蛋白（TRADD）和 TNF 受体相关因子（TRAF2）相互作用，并在受体介导的信号转导中发挥调节作用。

如图 1 所示，TNF-α 首先与细胞膜上受体 TNFR1 结合，从而触发 TNF-α 的三聚化以及 TNFR1 的胞内结构域相关complex I 的组装，其中 complex I 是由 TRADD、TRAF2、胞内凋亡蛋白抑制因子 1（cIAP1 / 2）和受体相互作用蛋白 1（RIP1）组成。在 complex I 中，对活性调控起着关键作用的是 cIAP1、cIAP2 及 RIP1 等分子的泛素化，在不同情况下会激活下游不同的信号通路，并决定细胞的最终结局是存活、凋亡还是坏死性凋亡[7]。

2.2 complex I 的激活

在 complex I 的激活中，RIP1 作为关键蛋白首先被多种泛素化迅速修饰，然后泛素化的 RIP1 作为 IKK 复合体调节亚基（NEMO）和转化生长因子激酶 1（TAK1）招募的支架，可以分别引起 NF-κB 和 MAPK 激酶通路的激活[8]。这两条途径均可抑制 caspase8 的活化从而提高细胞的存活率；第二种情况是在缺少 cIAP1 或细胞 FLICE 抑制蛋白（cFLIP）时，RIP1 与 Fas 相关死亡域蛋白（FADD）和 caspase8 形成胞浆复合物 IIa，进而激活 caspase 级联并诱导细胞凋亡。在 caspase8 活性受到抑制的条件下，出现了第三种情况，即 RIP1 与 RIP3 和混合谱系激酶结构域蛋白（混合连接激酶结构域样蛋白，MLKL）共同形成了 complex IIb，介导坏死性凋亡。随后，在 complex IIb 中 RIP3 和 MLKL 被磷酸化并转运至质膜，介导膜透化。

图 1 TNFR1 介导的细胞存活、凋亡和坏死性凋亡通路

2.3 RIP1 的磷酸化

RIP1 作为坏死性凋亡的关键蛋白之一，其在 complex I 介导细胞存活的通路中扮演支架的角色，坏死杆菌素 1（Nec-1）可以抑制 RIP1 的激酶作用，而对 TNF 诱导的 NF-κB 通路没有影响[7]。Nec-1 可以抑制细胞的坏死性凋亡，这表明了 RIP1 的激酶活性对坏死性凋亡至关重要[9]。在 complex IIb 中包括 RIP1、RIP3、 MLKL 、FADD 和 caspase8。但其中的 caspase8 必须保持无活性[10]，以确保它不会使RIP1 切割。同时有研究通过 RIP1 激酶敲除突变小鼠实验也证实了 RIP1 激酶对坏死性凋亡是必要的。实验使用表达催化失活的 D138N 或 K45A RIP1 等位基因的突变小鼠和细胞，其对 TNF 诱导的坏死具有高度抗性[11]。

2.4 RIP3 的磷酸化

RIP3 是坏死性凋亡的关键下游介质[12]，其转录后修饰对调节坏死性凋亡非常重要。磷酸化的 RIP1 和 RIP3 通过 RIP 同源相互作用基序（RHIM）相互结合，形成坏死复合物。RIP1 在 Ser204 处磷酸化 RIP3 是促进坏死性凋亡的关键，RIP1 与 RIP3 相互作用引起的最关键变化的是后者的磷酸化。另外，RIP3 的二聚化也可以直接导致其自磷酸化从而激活下游的 MLKL，引起细胞坏死性凋亡[13-17]。RIP3 的激酶活性对于由 TNF 刺激引起的坏死性凋亡也是重要的，对于完全缺乏 RIP3 的突变小鼠来说，由于受到TNF 诱导的系统性炎症反应综合征（SIRS）的保护，小鼠可以正常发育。但是对于催化失活的 D161N RIP3 等位基因突变小鼠，则会以基因剂量依赖的方式激活 caspase8 依赖性细胞凋亡导致早期胚胎致死[18]。

2.5 MLKL 的激活

MLKL 是目前有报道的坏死性凋亡最具代表性的下游效应物，是 RIP3 的下游底物[19-20]，在小鼠的 S345/T349 位和人的 T357/S358 位被磷酸化。随后，通过构象变化将 p-MLKL 转化为八聚体，易位至质膜上，并在质膜上形成孔，从而使质膜透化[21]。活化的 MLKL 除质膜外还可能移位至细胞内细胞器膜，导致线粒体和溶酶体的透化[22-23]。其中，肌醇磷酸（IP）作为一种新发现的调节坏死性凋亡的分子，是 MLKL 寡聚化和定位于质膜的关键因子[24]。

3 坏死性凋亡与恶性肿瘤密切相关

众所周知，癌症的发生与细胞死亡密切相关，除细胞凋亡外，坏死性凋亡同样也与癌症的发展有关。然而，有研究证明，坏死性凋亡在癌症进展和发展中起着双重作用[25]。其中，靶向坏死蛋白对肿瘤的发生和发展具有双重影响[26]。

一般研究认为，坏死性凋亡的功能障碍与肿瘤的发生和发展有关。例如，RIP3 的表达在患有急性髓性白血病（AML）的患者中显著下调，急性髓性白血病是已知阻断造血分化和细胞死亡的侵袭性造血系统恶性肿瘤。RIP3 的减少降低了造血细胞的死亡，这与 AML 的发生有关[27]。另有一项研究报道，RIP3 的遗传缺陷通过增加白血病起始细胞的积累将 FLT3-ITD 和 RUNXETO 驱动的小鼠骨髓增殖转变为 AML[28]。因此，RIP3 在 AML 发病机制中的作用可能由细胞环境决定。此外，MLKL 的低表达与手术后结肠癌患者的总体存活率降低相关[29]。MLKL 在胰腺癌和宫颈鳞状细胞癌中也被下调，其中血浆中低水平的 MLKL 预示胰腺癌和卵巢癌的预后不良[30-31]。总而言之，该信息为研究肿瘤发展中的坏死蛋白提供了研究方向。

近年来有研究发现，细胞对坏死性凋亡的抵抗往往是由癌基因介导的，这表明从坏死性凋亡中逃脱可能是类似于逃避细胞凋亡的肿瘤潜在标志[32]。

4 坏死性凋亡在肿瘤治疗中的研究进展

研究已经证明通过传统的坏死性凋亡诱导物或现有的化学治疗剂可以使许多癌细胞系发生坏死，这些癌细胞系涵盖几乎所有的常见癌症类型，尤其是结直肠癌细胞和造血系统肿瘤（例如白血病和多发性骨髓瘤）对坏死性凋亡诱导物更敏感[33]。

基于坏死性凋亡的肿瘤治疗是现今抗肿瘤治疗的新策略，但其可行性仍然存在很大争议。支持者认为，由于坏死性凋亡和细胞凋亡通过不同的信号通路发挥作用，诱导肿瘤细胞的坏死性凋亡有潜力作为治疗抗细胞凋亡的恶性肿瘤的替代疗法。根据现阶段的研究，这个假设已经被初步验证。但质疑者则认为，在许多癌细胞中已经观察到坏死机制存在先天或后天缺陷，使用的坏死诱导物是否能选择性地杀死癌细胞而不干扰正常细胞活动以及是否会导致生物体内去炎症作用等问题仍然有待进一步的研究。

事实上，除了已有证据表明的天然产物，如紫草醌等可以诱导细胞发生坏死性凋亡，许多最近已被批准用于临床试验的传统化疗或分子靶向药物，已在某些癌症类型中被鉴定为癌症坏死诱导物[34-35]，如 VEGFR 抑制剂、m-TOR 抑制剂等。在癌细胞中诱导坏死并不一定对正常细胞有毒性甚至导致严重的体内副作用。同时，为了进一步增强药物的特异性和选择性，也可考虑使用坏死诱导物与肿瘤靶向药物结合，以增加药物对肿瘤细胞作用的特异性[36]，如使用 IFN-γ 与蛋白酶体抑制剂硼替佐米联用来抑制肿瘤细胞。

5 总结与展望

作为一种不同于传统理论的细胞死亡方式，坏死性凋亡受到了越来越广泛的关注。它能够诱导与抑制机体多种疾病的发展与变化。坏死性凋亡的激活过程涉及死亡受体的激活，细胞存活及凋亡通路抑制，complex I、complex IIb 的形成及 MLKL 磷酸化激活生成坏死小体。进一步深入研究坏死性凋亡在机体内特别是恶性肿瘤中的作用，不仅有利于加深对细胞内信号分子、机体内稳态维持的进一步认识，而且对肿瘤治疗靶点的确证、新型治疗药物的研究以及肿瘤耐药机制研究也具有重要意义。

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“重大新药创制”国家科技重大专项（2018ZX09711001- 009-003）；中央级公益性科研院所基本科研业务专项（2016ZX350056）

弓建华，Email：ann_gong@hotmail.com；刘秀均，Email：liuxiujun2000@163.com

2019-01-16

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.02.012