胞外囊泡对血管生成影响的研究进展

刘月荣，陈曦，田野



胞外囊泡对血管生成影响的研究进展

刘月荣，陈曦，田野

150001 哈尔滨医科大学附属第一医院心内科

胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是由不同细胞产生并释放到细胞外的囊泡。最初被认为是无生物学功能的细胞碎片，现在发现其在血管生成、免疫调节、组织修复等过程中发挥重要作用。EVs 携带了许多表面受体、遗传物质、生物活性分子等，在细胞间传递信息，从而在血管生成过程中发挥了重要作用。本文就 EVs 对血管生成影响的研究进展综述如下。

1 胞外囊泡的产生和生物学特性

EVs 是指在正常和应激状态下由不同细胞产生的脂质双分子层包绕的球囊状结构[1]。根据其大小和生成途径，EVs 可分为 3 种主要类型：外泌体、微泡和凋亡小体。外泌体的直径在 30 ~ 120 nm 之间，微泡直径在 100 ~ 1000 nm 之间，凋亡小体直径在 800 ~ 5000 nm 之间。外泌体是由细胞膜与胞体内陷形成的多泡体融合释放而成，微泡则直接由细胞膜出芽生成，凋亡小体是由 caspase 介导的程序性死亡细胞出泡形成的[2]。研究发现，某些特异蛋白在 EVs 的生成和释放中发挥重要的作用，如四跨膜蛋白家族分子（CD81、CD9 和 CD63）、热休克蛋白（heat shock proteins，HSP90）、转运必需内体分选复合物（Tsg101、Alix）、参与膜融合的蛋白质（Rabs、ARF6）和信号蛋白等[3-4]。此外，这些过去被认为是外泌体特异性的蛋白也可以在微泡中被检测出。所有 EVs 亚群体中的蛋白质分布不均匀[5-6]。不同的细胞产生的 EVs 往往带有其细胞膜上的特异性受体。而 EVs 膜脂质组成及分布与母细胞不相同[3]。EVs 的质膜富含磷脂酰丝氨酸、糖鞘脂、鞘磷脂、神经酰胺和胆固醇。而在 EVs 上表达的磷脂酰丝氨酸是其特征之一。除表面分子外，EVs 中还含有可溶性因子，如细胞因子、生长因子和转录因子[3]。除了蛋白质和脂类，EVs 还可以整合遗传物质，例如小而长的编码和非编码的 RNA（mRNA、miRNA 和 IncRNA），以及其他细胞质成分和分子。

2 EVs 与血管生成

血管生成是指在已经存在的血管网络中形成新的血管的过程，存在于有机体的生长和发育中。血管生成有以下两种方式：一种是出芽式血管生成，经过血管基底膜降解，内皮细胞（endothelial cells，ECs）的增殖、迁移、发芽、分枝，形成新血管；另一种是套叠式血管生成，通过间质组织侵入现有血管，形成跨血管组织柱，随后血管扩张和分裂形成新血管。新血管结构的稳定和成熟需要周细胞的聚集、细胞外基质的沉积和剪切应力的机械刺激[2]。在健康的组织中，血管生成被促血管生成信号和抗血管生成信号精确平衡地调控。当这种平衡受到干扰时，就会出现血管生成异常，这是许多疾病进展的主要原因，如癌症、动脉粥样硬化、角膜新生血管、类风湿关节炎和缺血性疾病等。因此，EVs 在血管形成过程中发挥重要的作用（表 1）。

2.1 EVs 促血管生成的作用机制

EVs 可通过向 ECs 传递促血管生成的 miRNA 发挥促血管生成作用。ECs 源性的外泌体中的 miR-214通过抑制其他内皮细胞 ATM 的表达，在体外和体内发挥促血管生成作用[7]。经过 IL-3 刺激的 EC 产生的 EVs 通过将 miR-126-3p 转移到受体 EC，导致 Spred-1 降低，ERK1/2 激活，从而促进血管生成[8]。另一项研究发现，内皮细胞凋亡小体中的 miR-126 可以通过诱导动脉粥样硬化小鼠靶细胞中 CXCL 12 的表达和内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPC）的募集发挥促血管生成的作用，并增加斑块稳定性而产生抗动脉粥样硬化作用[9]。另一项研究发现，内皮克隆形成细胞（endothelial colony-forming cells，ECFC）的EVs 还可以预防大鼠肾缺血再灌注损伤后毛细血管稀疏和组织损伤。去除 EVs 中的 miR-126 和 miR-296 肾脏保护作用消失，说明 miR-126 和 miR-296 血管生成中起关键作用[10]。脂肪来源的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）通过外泌体将 miR-125a 转运至 EC，抑制 DLL4 表达，增加顶细胞的形成，在体内外发挥促血管生成的作用[11]。此外，用内皮分化培养基对脂肪源性 MSCs 预处理可使微泡生成增加，这些微泡通过传递 miR-31 和抑制低氧诱导因子-1α 的抑制因子表达，增强促血管生成的作用[12]。小鼠骨髓来源的 MSC 经过脑缺血组织提取物处理后产生的 EVs 富含 miR-210，miR-210 被转运至内皮细胞中抑制 EFNA3 基因的表达，促进血管生成[13]。同时，人脐带源性 MSC 产生的外泌体通过激活 Wnt 4/β-catenin 通路发挥促血管生成作用[14]。研究发现，单核细胞源性的微泡可以通过将 miR-150 转运到 EC 发挥促血管生成的作用[15]。

表 1 EVs 调控血管生成的主要机制

EVs 可以通过转运某些蛋白质发挥促血管生成的作用。通过调节细胞的培养条件，可以大大提高 EVs 的血管生成潜能。研究发现用血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）处理脂肪源性 MSCs 产生的 EVs 中c-kit、干细胞因子（stem cell factor，SCF）和基质金属蛋白酶含量的增加，从而增强其促血管生成作用。低氧处理脐带源性 MSCs 产生的 EVs 富含 VEGF，从而增加促血管生成的作用。单侧肾缺血大鼠经静脉注射这种 EVs，增加了缺血肾脏的毛细血管密度，从而发挥保护肾功能的作用[16]。血小板产生的微泡能促进内皮细胞迁移、增殖、管状结构的形成，同时增强损伤后内皮再生的能力。研究发现，用从动脉粥样硬化患者外周血中分离的血小板源性微泡处理循环血管生成细胞，可使大鼠缺血的后肢新生血管增多[17]。这种促血管生成作用与血小板源性微泡释放的受激活调节正常 T 细胞表达和分泌因子有关。在主动脉环模型鼠中，血小板源性微泡通过传递血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor-2，FGF-2）和 PDGF 以及激活 PI3 激酶、src 激酶和 ERK 通路，以剂量依赖性的方式发挥促血管生成作用[18]。同时，在慢性心肌缺血的大鼠模型中，静脉注射血小板微泡可增加心肌功能和毛细血管的数量，保护心功能。此外，C 反应蛋白（C-reactive protein，CRP）具有促血管生成的作用。2012 年澳大利亚学者在急性心肌梗死的患者血液标本中发现微泡可以转运单体 CRP 至ECs 并活化 ECs[19]。近期研究发现，携带音猬因子（sonic hedgehog，SHH）的微泡通过抑制 NO 的产生和减少氧化应激，改善了血管紧张素 II 诱导的高血压和主动脉内皮功能[20]。

EVs 也可以通过转运一些转录因子发挥促血管生成的作用，如 pSTAT 3 和 pSTAT 5。研究发现，在缺血状态下，骨髓源性 MSCs 的外泌体通过转运 pSTAT 3 及激活 NF-κB 通路发挥促血管生成的作用[21-22]。而 IL-3 处理的ECs 产生的 EVs 通过将 pSTAT 5转运到 EC，增加 cyclinD1 翻译，从而促血管生成[8]。

2.2 EVs 抗血管生成的作用机制

EVs 的抗血管生成作用在视网膜病变和肿瘤血管生成等病理性血管生成方面具有重要的治疗作用。EVs 诱导内皮细胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生，通过内皮细胞的 CD36 和 EVs 磷脂酰丝氨酸结合，激活 Fyn 激酶和 NADPH 氧化酶，产生活性氧，抑制 ECs 迁移和管腔形成[23]。研究发现，T 淋巴细胞产生的微泡对血管生成的抑制作用是由低密度脂蛋白受体介导的，将靶 ECs 和肿瘤细胞中的低密度脂蛋白受体敲除，导致微泡摄取减少，导致 T 淋巴细胞微泡抗血管生成作用消失[24]。

3 EVs 治疗血管生成的前景

在各种研究的基础上，EVs 已经成为细胞间通讯的主要形式，在血管生成中起着重要的作用。EVs 广泛参与了血管生成、生长和成熟。自 21 世纪初以来，EVs 已在黑色素瘤[25]、非小细胞肺癌[26-27]、结直肠癌[28]、I 型糖尿病（Nct 02138331）患者中进行了临床试验。虽然参与研究的患者数量不多，但这些临床试验证明了 EVs 在人体内应用的可行性和安全性。最近，一项前瞻性的临床试验被启动，评价自体血浆来源的外泌体对顽固性皮肤溃疡（Nct 02565264）患者伤口愈合的影响。这项临床试验将提供关于 EVs 干预血管生成的可行性和有效性的重要信息。

4 问题与展望

EVs 领域的研究发展迅速，现在已经成为了研究热点，尤其在癌症、卒中等疾病中研究广泛。EVs 不仅可以通过自身发挥作用，还可以通过运输药物发挥作用，甚至用于一些基因治疗。由此可见 EVs 是极具前景的领域。越来越多的研究证实了 EVs 通过调节 ECs 参与血管生成。与其他调节肿瘤、脑卒中、动脉粥样硬化、损伤后修复等疾病中的血管生成的方法相比，EVs 治疗具有靶向性、无免疫原性、无致瘤性、安全性、储存和运输方便等优点。EVs 将有希望成为干预血管生成的新手段，但 EVs 研究仍面临着许多挑战。其中关于 EVs 的应用浓度仍然存在很大争议。研究发现，EVs 对血管生成的影响是与剂量相关的。而现有研究 EVs 的量化方法不同，所以 EVs 发挥调节血管生成而又无副作用的浓度无法确定。不同的分离和提纯 EVs 的方法也影响其完整性及功能。此外，EVs 的细胞来源和给药途径是其组织分布的关键决定因素。因此，在正常和病理条件下建立 EVs 的最佳给药途径、产生条件、统一分离提纯及量化方法有助于提高其治疗效果。

[1] Raposo G, Stoorvogel W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol, 2013, 200(4):373-383.

[2] Todorova D, Simoncini S, Lacroix R, et al. Extracellular vesicles in angiogenesis. Circ Res, 2017, 120(10):1658-1673.

[3] Yáñez-Mó M, Siljander PR, Andreu Z, et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles, 2015, 4:27066.

[4] Colombo M, Raposo G, Théry C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol, 2014, 30:255-289.

[5] Colombo M, Moita C, van Niel G, et al. Analysis of ESCRT functions in exosome biogenesis, composition and secretion highlights the heterogeneity of extracellular vesicles. J Cell Sci, 2013, 126(Pt 24): 5553-5565.

[6] Urbanelli L, Buratta S, Sagini K, et al. Exosome-based strategies for diagnosis and therapy. Recent Pat CNS Drug Discov, 2015, 10(1): 10-27.

[7] van Balkom BW, de Jong OG, Smits M, et al. Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells. Blood, 2013, 121(19):3997-4006, S1-S15.

[8] Lombardo G, Dentelli P, Togliatto G, et al. Activated stat5 trafficking via endothelial cell-derived extracellular vesicles controls IL-3 pro-angiogenic paracrine action. Sci Rep, 2016, 6:25689.

[9] Zernecke A, Bidzhekov K, Noels H, et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Sci Signal, 2009, 2(100):ra81.

[10] Cantaluppi V, Gatti S, Medica D, et al. Microvesicles derived from endothelial progenitor cells protect the kidney from ischemia-reperfusion injury by microRNA-dependent reprogramming of resident renal cells. Kidney Int, 2012, 82(4):412-427.

[11] Liang X, Zhang L, Wang S, et al. Exosomes secreted by mesenchymal stem cells promote endothelial cell angiogenesis by transferring miR-125a. J Cell Sci, 2016, 129(11):2182-2189.

[12] Kang T, Jones TM, Naddell C, et al. Adipose-derived stem cells Induce angiogenesis via microvesicle transport of miRNA-31. Stem Cells Transl Med, 2016, 5(4):440-450.

[13] Moon GJ, Sung JH, Kim DH, et al. Application of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles for stroke: biodistribution and microRNA study. Transl Stroke Res, 2018. [Epub ahead of print]

[14] Zhang B, Wu X, Zhang X, et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes enhance angiogenesis through the Wnt4/beta- catenin pathway. Stem Cells Transl Med, 2015, 4(5):513-522.

[15] Li J, Zhang Y, Liu Y, et al. Microvesicle-mediated transfer of microRNA-150 from monocytes to endothelial cells promotes angiogenesis. J Biol Chem, 2013, 288(32):23586-23596.

[16] Zou X, Gu D, Xing X, et al. Human mesenchymal stromal cell-derived extracellular vesicles alleviate renal ischemic reperfusion injury and enhance angiogenesis in rats. Am J Transl Res, 2016, 8(10):4289-4299.

[17] Ohtsuka M, Sasaki K, Ueno T, et al. Platelet-derived microparticles augment the adhesion and neovascularization capacities of circulating angiogenic cells obtained from atherosclerotic patients. Atherosclerosis, 2013, 227(2):275-282.

[18] Brill A, Dashevsky O, Rivo J, et al. Platelet-derived microparticles induce angiogenesis and stimulate post-ischemic revascularization. Cardiovasc Res, 2005, 67(1):30-38.

[19] Habersberger J, Strang F, Scheichl A, et al. Circulating microparticles generate and transport monomeric C-reactive protein in patients with myocardial infarction. Cardiovasc Res, 2012, 96(1):64-72.

[20] Marrachelli VG, Mastronardi ML, Sarr M, et al. Sonic hedgehog carried by microparticles corrects angiotensin II-induced hypertension and endothelial dysfunction in mice. PLoS One, 2013, 8(8):e72861.

[21] Anderson JD, Johansson HJ, Graham CS, et al. Comprehensive proteomic analysis of mesenchymal stem cell exosomes reveals modulation of angiogenesis via nuclear factor-kappaB signaling. Stem Cells, 2016, 34(3):601-613.

[22] Shabbir A, Cox A, Rodriguez-Menocal L, et al. Mesenchymal stem cell exosomes induce proliferation and migration of normal and chronic wound fibroblasts, and enhance angiogenesis in vitro. Stem Cells Dev, 2015, 24(14):1635-1647.

[23] Ramakrishnan DP, Hajj-Ali RA, Chen Y, et al. Extracellular vesicles activate a CD36-dependent signaling pathway to inhibit microvascular endothelial cell migration and tube formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2016, 36(3):534-544.

[24] Yang C, Xiong W, Qiu Q, et al. Role of receptor-mediated endocytosis in the antiangiogenic effects of human T lymphoblastic cell-derived microparticles. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2012, 302(8):R941-R949.

[25] Escudier B, Dorval T, Chaput N, et al. Vaccination of metastatic melanoma patients with autologous dendritic cell (DC) derived-exosomes: results of thefirst phase I clinical trial. J Transl Med, 2005, 3(1):10.

[26] Morse MA, Garst J, Osada T, et al. A phase I study of dexosome immunotherapy in patients with advanced non-small cell lung cancer. J Transl Med, 2005, 3(1):9.

[27] Besse B, Charrier M, Lapierre V, et al. Dendritic cell-derived exosomes as maintenance immunotherapy after first line chemotherapy in NSCLC. Oncoimmunology, 2016, 5(4):e1071008.

[28] Dai S, Wei D, Wu Z, et al. Phase I clinical trial of autologous ascites-derived exosomes combined with GM-CSF for colorectal cancer. Mol Ther, 2008, 16(4):782-790.

国家自然科学基金（81371709）

田野，Email：yetian6@163.com

2018-12-06

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.02.011