吸烟者外周血不同T淋巴细胞亚群在体外扩增中的异常增殖及功能研究

葛汝村，李培培，李安娜，徐林，戴晓宇，王换换，李栋



吸烟者外周血不同T淋巴细胞亚群在体外扩增中的异常增殖及功能研究

葛汝村，李培培，李安娜，徐林，戴晓宇，王换换，李栋

250031 济南，山东省立第三医院再生医学研究室（葛汝村、李培培、徐林）；250012 济南，山东大学齐鲁医院低温医学研究室（李安娜、戴晓宇、王换换、李栋）

检测吸烟对外周血 T 淋巴细胞体外扩增培养过程中免疫杀伤细胞和调节性 T 细胞增殖和功能的不同影响。

选择平均年龄 30 岁的男性吸烟者 27 例与不吸烟男性健康对照组 16 例，采用密度梯度离心法从外周血中分离淋巴细胞，添加抗 CD3 和抗 CD28 抗体，以及 IL-2 和 IFN-γ 等多种细胞因子扩增培养 15 d，计算细胞的增殖率，并利用流式细胞术检测扩增后各组淋巴细胞中免疫杀伤细胞（CD3+CD8+细胞、CD3+CD56+细胞）以及调节性 T 细胞（CD4+CD25+细胞）的比率；CCK8 法检测扩增后的免疫杀伤细胞对 HeLa 细胞的杀伤力，PCR 方法检测扩增后淋巴细胞部分功能相关基因的表达。

吸烟者外周血淋巴细胞增殖能力减弱，且免疫杀伤细胞所占比例低，调节性 T 细胞所占比例高；吸烟者细胞免疫杀瘤细胞的杀伤力明显低于不吸烟对照组，吸烟组淋巴细胞表达的 TNF-α、颗粒酶、穿孔素和 IFN-γ 等均有不同程度降低，其中颗粒酶和颗粒溶解素下调较为明显；但吸烟组 TGF-β1 的表达量显著上调，约为对照组的 7 倍。

吸烟导致扩增后的外周血淋巴细胞中免疫杀伤细胞所占比例减少，调节性 T 细胞比例增加，吸烟组 TGF-β1 的表达增加进一步抑制了免疫杀伤细胞的活化和增殖。

吸烟； T 淋巴细胞，调节性； 转化生长因子-β； 免疫杀伤细胞

众所周知吸烟有害健康，中国每年大约12% 的男性死于烟草的使用。烟草含有包括尼古丁在内的 1200 多种有害物质，其中 10 多种为致癌物质，这些有害物质能明显降低人体的免疫功能，降低人体的免疫反应能力[1]，使人易患肺癌、膀胱癌、心脏病等诸多疾病[2-4]。杀伤性 T 淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）与调节性 T 细胞（regulatory T cells，Treg）在机体免疫系统功能中发挥重要作用[5-6]，本研究拟通过比较吸烟者与不吸烟者外周血 T 淋巴细胞在体外扩增中的增殖力、杀瘤力和相关基因的表达，探讨吸烟降低机体免疫功能的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂与仪器 RPMI 1640 培养基购自美国 Hyclone 公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国 Gibco公司；羊抗人 CD3 抗体和羊抗人 CD28 抗体购自北京同立海源生物科技有限公司；白介素 IL-2、IL-15、γ 干扰素（interferon-γ，IFN-γ）和 PE 荧光单克隆抗体试剂 IgG1、CD3、CD25、FITC 荧光单克隆抗体试剂IgG1、IgG2b、CD4、CD8、CD56 均购自美国 R&D 公司；人外周血淋巴细胞分离液（密度 1.077）购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司；RealMasterMix SYRB Green PCR 试剂盒和 Cell counting kit8 试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；450 型酶标仪为 BD公司产品；Guava easy Cyte8HT 流式细胞仪购自美国 EMD Millipore 公司；7500 荧光定量 PCR 仪为美国ABI 公司产品。

1.1.2 实验对象 吸烟组：年龄24 ~ 39（平均年龄 30 岁）的男性（n = 27），经临床全面体检，肝功能检查正常，甲胎蛋白（AFP）及乙肝病毒表面抗原（HBsAg）阴性，血糖正常，排除患有疾病者。吸烟标准：平均每天吸烟大于等于 10 支，列为吸烟组。对照组：生活在同一地区，平均年龄 30 岁（n = 16），从未吸烟的男性，经临床全面体检，肝功能检查正常，AFP 及 HBsAg 阴性，血糖正常，排除患有疾病者。

1.2 方法

1.2.1 人外周血 T 淋巴细胞亚群的体外扩增 经供者授权同意后，在一周内完成吸烟组和对照组的随机静脉采血。在无菌条件下，用肝素钠抗凝的真空采血管采集供者外周静脉血 20 ml，常规梯度密度离心法（密度 = 1.077 g/L）获得单个核淋巴细胞，使用含 10% FBS 的 RPMI 1640 培养基作为淋巴细胞扩增基础培养基，按终浓度加入 PHA（2 μg/ml）、IFN-γ（50 ng/ml），细胞起始培养密度为5 × 106个/ml。置于 37 ℃、5% CO2、100% 饱和湿度的细胞培养箱内培养。次日加入抗 CD3（50 ng/ml）、抗 CD28（50 ng/ml）、IL-2（1000 U/ml）和 IL-15（10 ng/ml）。以后每 2 ~ 3 天添加培养液并按终浓度加入 IL-2（1000 U/ml)）和 IL-15（10 ng/ml）。每 3 天抽取少量细胞计数。

1.2.2 流式细胞术检测细胞表型 取预检测细胞，用 PBS 液 1000 r/min 离心 5 min 洗涤细胞 2 次，弃上清。细胞沉淀加入 120 μl 鞘液充分吹悬并用 70 μm 滤网过滤，分别加入 PE 或 FITC 标记的单克隆抗体以及相应的同型对照抗体 5 μl，充分涡旋振荡混匀，避光孵育 15 min 后，加入 1000 μl 流式鞘液充分混匀后 1000 r/min 离心5 min 并离心洗涤 1 次，进行流式细胞检测，流式分析软件 Guava Incyte 分析所得数据。

1.2.3 CCK8 法检测扩增后 T 淋巴细胞对HeLa 细胞的杀伤率 HeLa 细胞培养于含 10% FBS 的 RPMI 1640 培养基中，消化后以每孔 1 × 105个/100 μl种于 96 孔板中，培养 12 h 后，每孔加入100 μl 扩增后的 T 淋巴细胞悬液（含 10% FBS 的RPMI 1640 培养基中细胞 1 × 106个），效靶比为 10:1，在培养箱孵育 6 h，然后向每孔加入 10 μl CCK8 溶液，培养箱内继续孵育 1 h，酶标仪测定 450 nm 处的吸光度。计算公式如下：

细胞杀伤率 =[1 –（效靶细胞值– 效应细胞值）/靶细胞值]× 100%

1.2.4 Real-time PCR 检测基因表达 取上述各组扩增前后单个核细胞各 1 × 106个，以新鲜分离的健康人外周血 MNC 细胞作为对照组，提取 RNA，并反转录为 cDNA，以反转录产物为模板进行 PCR，各基因检测用引物序列见表 1，操作步骤如下进行，反应体系为20 μl：10 μl 2 × Ultra SYBR Mixture，前后引物（10 μmol/L）各 1 μl，模板 1 μl。反应程序为：95 ℃预变性 10 min；随后进行 40 个循环 95 ℃变性 15 s；60 ℃退火/延伸 1 min 读板。每个样本 3 次重复，以 GAPDH 为内参基因，先按照公式ΔΔCT = ΔCT待测– ΔCT对照对各试验样本的ΔCT值进行归一，再用2−ΔΔCT计算各组的相对表达量，并将新鲜对照组的表达值设为 1。

1.3 统计学处理

表 1 定量 PCR 中所用引物序列

2 结果

2.1 淋巴细胞增殖检测

淋巴细胞增殖是机体免疫应答过程的一个重要阶段。因此，检测淋巴细胞增殖水平是细胞免疫研究和临床免疫功能检测的一种常用方法。为了探究吸烟是否能够影响机体的免疫力，首先分离淋巴细胞，然后经 IFN-γ、抗 CD3 抗体和 IL-2 等激活扩增 T 淋巴细胞培养后计数，可见前 3 天细胞生长缓慢，细胞密度低（图 1A），但健康正常组T 细胞在第 3 天即进入快速增殖期，而吸烟组的 T 细胞第 6 天才进入快速增殖期。快速增殖的淋巴细胞密度显著增加，并形成克隆球（图 1B）。经过 21 d 的培养，对照组（不吸烟）细胞总数增殖倍数平均约为 36 倍，而吸烟组细胞仅扩增25.7 倍左右，明显低于对照组（< 0.01），如图 1C 所示。

2.2 吸烟组淋巴细胞扩增后免疫杀伤细胞比例减少，调节性 T 细胞比例增加

扩增方案不但可以扩增杀伤性 T 淋巴细胞[6]，也可以扩增调节性 T 淋巴细胞[7]，流式细胞术结果显示扩增后吸烟组免疫 T 淋巴杀伤细胞（CD3+CD56+和 CD3+CD8+细胞）所占比例低于对照组，而调节性 T 淋巴细胞（CD4+CD25+）所占比例为（8.99 ± 0.85）%，显著高于对照组的（1.70 ± 0.32）%（= 40.12，< 0.01），如图 2A 所示。

2.3 吸烟者淋巴细胞杀瘤能力低于对照组

将吸烟组与对照组扩增后的 T 淋巴细胞与 HeLa 细胞共培养，检测其对肿瘤细胞的杀伤力，结果显示对照组淋巴细胞杀伤率为（77.01 ± 1.19）%，吸烟组淋巴细胞杀伤率平均仅为（56.37 ± 7.90）%，两者具有极显著差异（= 13.32，< 0.001），如图 2B 所示。

2.4 吸烟可以降低杀伤相关基因表达，促进 TGF-β1 的表达

为了进一步研究吸烟对 T 淋巴细胞的影响，利用 Real-time PCR 技术检测了两组扩增后的淋巴细胞中，部分免疫杀伤相关基因以及 TGF-β1 的 mRNA 表达量，结果显示与对照组相比，吸烟组淋巴细胞表达的 TNF-α、颗粒酶A 和 B、颗粒溶解素、穿孔素和 IFN-γ 等均有不同程度降低，其中颗粒酶和颗粒溶解素下调较为明显（< 0.01）；但吸烟组 TGF-β1 的表达量显著上调，约为对照组的 7 倍（= 89.35，< 0.001），如图 2C 所示。

3 讨论

烟草中主要成分尼古丁能迅速溶于水及酒精中，通过口鼻支气管黏膜很容易被机体吸收，对人体产生多种危害。例如尼古丁可抑制人牙周膜成纤维细胞的生长，使处于增殖状态的牙周膜成纤维细胞阻滞于 G2/M，使牙周膜丧失自我修复的能力[8]。在本研究中，结果显示吸烟可以抑制外周血中免疫杀伤细胞（CD3+CD8+、CD3+CD56+）的增殖，上调扩增产物中调节性 T 细胞（CD4+CD25+）的比例。

尼古丁对淋巴细胞的影响主要是通过 CD4+细胞表达的烟碱样乙酰胆碱受体发挥作用的，从而对 T 淋巴细胞活化、增殖和分泌细胞因子产生影响[9-11]，同样尼古丁也可以通过PI3-K/Akt 途径上调环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，Cox-2）和前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）的产量[12]。尼古丁结合烟碱样乙酰胆碱受体还可以引起 cAMP 和 Ca2+动员[13]，从而全面影响免疫细胞功能，例如尼古丁可以降低牙龈组织中的免疫细胞数目、趋化性和吞噬能力，从而降低牙龈组织的免疫防御力[14]。如果在妊娠期吸烟[尼古丁量 6 mg/(kg·d)]就会长期抑制免疫细胞的增殖[15]。PCR 的结果还显示吸烟组淋巴细胞表达的 TNF-α、颗粒酶 A 和 B、穿孔素和 IFN-γ 等相关细胞因子的表达水平均降低，其中颗粒酶和颗粒溶解素下调较为明显。免疫杀伤细胞的杀伤率是考量机体免疫力的一个重要参数。我们检测吸烟组与对照组淋巴细胞对 HeLa 细胞的杀伤力，结果显示吸烟组对 HeLa 细胞的杀伤力明显低于对照组，这与穿孔素和 IFN-γ 等多种基因的表达下调直接相关。

图 1 细胞增殖能力检测（A：扩增前的淋巴细胞；B：进入快速扩增期的淋巴细胞；C：到第 21 天对照组细胞增殖倍数约为 36 倍，吸烟组细胞增殖约 25.7 倍，在扩增细胞总数上比正常组有显著降低，*P < 0.01）

Figure 1 Cell proliferation assay (A: Lymphocytes before amplification; B: Lymphocytes in the rapid expansion phase; C: The lymphocytes in control group proliferated about 36 times after 21 days culture, while the smoking group only amplified about 25.7 times,*< 0.01)

图 2 扩增后淋巴细胞的免疫表型、杀瘤能力及基因表达分析[A：扩增后吸烟组免疫 T 淋巴杀伤细胞（CD3+CD56+和 CD3+CD8+细胞）所占比例低于对照组，而调节性 T 淋巴细胞（CD4+CD25+）显著高于对照组；B：淋巴细胞对 HeLa 细胞杀伤结果显示吸烟组的淋巴细胞杀伤率比对照组低约20%；C：定量 PCR 检测扩增后 T 细胞内部分基因的表达，以新鲜分离的健康人外周血 MNC 细胞作为对照组，并将其表达值设为 1；*P < 0.01 vs.对照组；**P < 0.001 vs.对照组]

Figure 2 Immune phenotype, tumor killing ability and gene expression analysis after lymphocytes amplification [A: Cytotoxicity T lymphocyte (CD3+CD56+and CD3+CD8+cells) is lower in smoking group than the control group, but regulatory T cells (CD4+CD25+) regulatory T cells was significantly higher than the control group; B: Tumor killing ability of smoking group is lower than the control group about 20%；C: The expression of some important genes in expanded T cells, compared with fresh isolated MNC as control (set the value as 1);*< 0.01control group;**< 0.001control group]

但研究发现，尼古丁并不杀死免疫细胞，相反的，尼古丁可以抑制地塞米松诱导的免疫细胞凋亡[16]，实验结果发现吸烟者在相同的 T 淋巴细胞增殖刺激下，产生的 Treg 细胞比例增高。研究显示 TGF-β 可以诱导 CD4+CD25-细胞转变为 CD4+CD25+Treg 细胞[17]。于是采用定量 PCR 的方式检测了 TGF-β 在核酸水平的表达量变化，结果显示吸烟组的 PBMC 培养扩增 15 d 后，吸烟组 TGF-β1 的表达量显著上调，约为对照组的7 倍，所以我们猜测吸烟引发吸烟者淋巴细胞中调节性 T 细胞比例的增加是由于 TGF-β 的过量表达所致。

综上所述，吸烟降低机体免疫力的机制可能是由于吸烟导致免疫杀伤细胞数量减少而且功能下降；并且尼古丁可以促进淋巴细胞中 TGF-β 的表达，TGF-β 诱导调节性 T 细胞 Treg 的比例增加，进一步抑制了免疫杀伤细胞的活化和增殖，从而导致机体免疫力降低，下一步我们将在体内动物实验中进一步验证尼古丁对免疫力的影响。

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Abnormal proliferation and function of different T lymphocyte subsets in peripheral blood of smokers

GE Ru-cun, LI Pei-pei, LI An-na, XU Lin, DAI Xiao-yu, WANG Huan-huan, LI Dong

Regenerative Medicine Laboratory, Shandong Provincial Third Hospital, Ji'nan 250031, China (GE Ru-cun, LI Pei-pei, XU Lin); Cryomedicine Laboratory, Qilu Hospital of Shandong University, Ji'nan 250012, China (LI An-na, DAI Xiao-yu, WANG Huan-huan, LI Dong)

To investigate the different effects of cigarette smoking on proliferation and function of immune killer cells and regulatory T cells during the expansion of peripheral blood T lymphocytes.

Twenty-seven male smokers and sixteen healthy controls of non-smokers with an average age of 30 years were selected. Peripheral lymphocytes were isolated using density gradient centrifugation. Anti-CD3 and anti-CD28 antibody, IL-2, IFN-γ and other cytokines were used for lymphocyte amplification for 15 days. Cell proliferation, and the ratio of killer T cells (CD3+CD8+cells, CD3+CD56+cells) and regulatory T cells (CD4+CD25+cells) were analyzed by FACS. CCK8 method was used to detect the tumor killing activity on HeLa cells. The expression of some immune related genes were detected using PCR method.

The proliferation ability of peripheral lymphocyte were decreased in smokers, while the proportion of regulatory T cells were high in smokers. Tumor killing activity was significantly lower in smoking group than that in control group. The expression of TNF-α, granzyme, IFN-γ and perforin were also reduced in smokers. But the expression of TGF-β1 was up-regulated in smoking group.

Smoking reduced immune killer cells rate in peripheral lymphocyte amplification but increased the proportion of regulatory T cell proportion. Up-regulation of TGF-β1 in smoking group further inhibits immune cell activation and proliferation.

Smoking; T lymphocytes, regulatory; Transforming growth factor beta; Immune killer cells

LI Dong, Email: lidong73@sdu.edu.cn

李栋，Email：lidong73@sdu.edu.cn

2018-12-18

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.02.008