磷脂酰胆碱特异性和磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C酶学性质及其在油脂脱胶中的应用

邹 权，陈 圣，严 明

(南京工业大学生物与制药工程学院，江苏南京211800)

酶法脱胶作为近几年发展起来的新型的植物油脱胶技术，相对于其他传统脱胶工艺，如水化脱胶、酸法脱胶、膜法脱胶[1]、Top脱胶、吸附脱胶[2-3]、超滤脱胶[4-5]和超临界CO2脱胶[6]等，具有适应性强、节能高效、绿色环保、中性油损失少，还能增加油脂得率等优点。酶法脱胶的原理主要是利用磷脂酶将毛油中的非水合磷脂水解掉一个脂肪酸生成溶血磷脂，溶血磷脂具有良好的亲水性，可以通过简单的水化方法去除。根据作用于磷脂不同位点可以将磷脂酶分为磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶B、磷脂酶C和磷脂酶D。其中，磷脂酶A1和磷脂酶A2分别水解磷脂Sn-1和Sn-2位的酯键生成溶血磷脂和脂肪酸；磷脂酶B则具有水解Sn-1和Sn-2位酯键的特性；磷脂酶C催化水解Sn-3位酯键，生成甘油二酯(DAG)和磷酸化合物；磷脂酶D则作用于磷酸和极性基团之间的磷酸单酯键。而根据磷酸基团上取代基-X的不同，磷脂又分为磷脂酸(PA)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰肌醇(PI)等[7]。

磷脂酶C主要作用于磷脂分子Sn-3酰基位点，水解磷脂得到甘油二酯和有机磷酸酯(磷酸胆碱、磷酸肌醇、磷酸乙醇胺和磷酸丝氨酸等)。其中，甘油二酯属于油脂的正常组分，甘油二酯的产生不但不会影响精炼油脂的品质，还能增加精炼油脂得率。而且，磷脂酶C水解磷脂后不会产生游离脂肪酸(FFA)，不会增加油脂的酸值，从而不影响油脂下游的精炼工艺和最终产品的质量[8]。

早在1988年，Graille等[9]就曾提出将磷脂酶C用于油脂脱胶，但受限于当时的高成本及酶制备技术不成熟等原因没有将其应用于工业生产中。随着商品植物油的价格持续上涨，油脂市场将注意力转到了磷脂酶C。与此同时，一些与磷脂酶C有关的脱胶工艺的专利[10]的出现促进了磷脂酶C在油脂脱胶领域的商业化[11]。最早的商业化磷脂酶C是Verenium公司在2008年American Oil Chemists’ Society(AOCS)年会上推出的Purifine®(PLC)，也是目前工艺最为成熟的PLC脱胶产品，将该产品应用于大豆油脱胶中，每降低500 mg/kg的磷脂质量分数，精炼油脂得率就提高1%[12]。近几年，国内对磷脂酶C的相关研究逐渐增加。如江南大学王兴国课题组先后在单增李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)[13]、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)[14]和金黄色葡萄球菌(Staphylococusaureus)[15]等菌中发现并克隆表达了这些磷脂酶C基因，并将其初步应用于植物油脱胶中，取得了良好的效果。但是目前所报道的磷脂酶C基因大部分都是PC或PE特异性，不具备水解PI和PA的功能。而PC和PE占大豆油或菜籽油中总磷脂的55%～77%，PI占大豆油中总磷脂的20%～24%[16]。这对于处理高磷含量的毛油来说不足以使脱胶油中磷含量达到一个较低的水平。

笔者通过基因组数据挖掘的方法，筛选到了2条分别具有PC、PE特异性磷脂酶C活性和PI特异性磷脂酶C活性的基因，并将其构建至枯草芽孢杆菌中进行分泌表达，并将其应用于植物油脱胶领域。本实验主要对这2条磷脂酶C基因的酶学性质进行表征并对它们在油脂脱胶中的性能进行研究，以期在油脂脱胶领域做出新的探索。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

蜡状芽孢杆菌，中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。载体质粒PMA5，优宝生物。克隆宿主E.coliDH5α和表达宿主枯草芽孢杆菌(Bacillussublitis)WB800保藏于南京工业大学基因工程与生物信息学实验室。

1.2 仪器与试剂

各种限制性内切酶、Prime STAR HS DNA聚合酶、T4 DNA连接酶，宝生物工程(大连)有限公司；细菌基因组试剂盒、质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；PCR引物合成，南京金斯瑞生物科技有限公司。抗生素、考马斯亮蓝、牛血清蛋白(BSA)及其余试剂，生工生物工程(上海)股份有限公司。

5804R型高速冷冻离心机，Eppendorf公司。粗制大豆油(初始磷含量531 mg/kg)，中粮集团有限公司。

1.3 PC、PE特异性磷脂酶C和PI特异性磷脂酶C在枯草芽孢杆菌中的克隆表达

通过查阅文献资料及序列比对，从NCBI数据库得到1条来源于蜡状芽孢杆菌的PC、PE特异性磷脂酶C基因序列(GenBank:WP017149985.1)并设计引物。上游引物：5′-GGAATTCCATATGAAAAAGAAAGTGTT-3′,下游引物：5′-CGGGATCCTTAGCGATTTCCGTATGTAT-3′(上下游引物分别引入NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点，划线处为酶切位点)。具有PI特异性磷脂酶C基因序列(GenBank:WP047338113.1)通过南京金斯瑞生物科技有限公司合成(在序列上下游分别引入NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点)。将获得的PC-PLC、PI-PLC以及质粒PMA5使用NdeⅠ和BamHⅠ限制性内切酶进行双酶切，用T4 DNA连接酶连接并转化至E.coliDH5α感受态细胞内。挑选阳性转化子送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，将测序正确的转化子扩大培养并提取质粒，将重组质粒PMA5-PCPLC以及PMA5-PIPLC电转至表达宿主枯草芽孢杆菌WB800(电转参数：电压2.0 kV，电容25 μF，电阻200 Ω)[17]。挑选阳性克隆进行酶切验证，验证正确的重组菌命名为B.sublitis/PMA5-PCPLC以及B.sublitis/PMA5-PIPLC。挑取重组菌单菌落，接种于含有30 mg/mL的卡那霉素抗性的5 mL液体培养基中，在37 ℃、200 r/min的恒温摇床中培养12 h。将培养12 h的菌液以体积分数2%的接种量接入含有30 mg/mL的卡那霉素抗性的100 mL液体培养基中，在37 ℃、200 r/min的恒温摇床中培养24 h后停止培养。用高速冷冻离心机将培养液离心分离，收集上清备用。

1.4 PC-PLC与PI-PLC粗酶液的制备及蛋白浓度测定

将重组菌发酵培养后所得上清液经过硫酸铵分级沉淀、透析除盐所得酶液即为粗酶液。粗酶液蛋白浓度测定采用常规Bradford法测定[18]。

考马斯亮蓝G-250标准曲线的绘制。

标准蛋白溶液：取10 mg牛血清蛋白，用蒸馏水定容至100 mL，配制成100 μg/mL的标准蛋白液。

考马斯亮蓝G-250溶液：取50 mg考马斯亮蓝G-250，加入25 mL 90%的乙醇溶液及85%磷酸溶液50 mL，定容至500 mL。

将标准蛋白液稀释成10、20、40、60、80及100 μg/mL的蛋白浓度梯度溶液，分别取1 mL放入10 mL试管中，每管加入5 mL考马斯亮蓝试剂，混匀，静置5 min，于595 nm测定其吸光值A595。以标准蛋白质量(mg)为横坐标、吸光度值A595为纵坐标作图，即得到标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595，即可获得未知样品的蛋白浓度。

1.5 PC-PLC与PI-PLC粗酶液酶学性质研究

酶活单位定义：每分钟催化水解磷脂生成1mmol/L甘油二酯所需的酶量为1个酶活单位(U)。

甘油二酯含量检测方法参照AOCS官方方法 Cd 11d-96[19]。

1.5.1 PC-PLC与PI-PLC的最适温度及温度稳定性

将反应体系分别在25～65 ℃条件下进行反应。以酶活最高为100%，其余酶活与之相比，计算其相对酶活，研究酶的最适温度。

将粗酶液放置在25～65 ℃条件下保温2 h，检测 2 h后的残余酶活。以未保温条件下酶活为100%，计算保温后的相对酶活，研究酶的温度稳定性。每组设置3个重复实验。

1.5.2 PC-PLC与PI-PLC的最适pH及pH稳定性

分别配制pH为4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和9.0的缓冲液，在不同的pH缓冲液条件下检测酶的活性，确定最适pH。

将粗酶液加入到不同pH的缓冲液溶液中，检测2 h后的残余酶活。以各pH下未处理酶液酶活为100%，计算相对酶活，研究酶的pH稳定性。每组设置3个重复实验。

1.5.3 金属离子对PC-PLC与PI-PLC酶活力影响

以不加金属离子反应体系中所测得酶活为100%，检测反应体系中加入了1 mmol/L的Mg2+、Ca2+、Zn2+、Fe3+、Mn2+、K+、Co2+和Ba2+后的酶活力，并计算相对酶活。

1.6 PC-PLC与PI-PLC用于大豆油酶法脱胶

1.6.1 脱胶方法

准确称取100 g大豆毛油于500 mL烧杯中，水浴加热到80 ℃，在烧杯中加入0.15 mL 45%柠檬酸溶液，10 000 r/min充分混匀1 min，然后在500 r/min、80 ℃条件下反应30 min，反应结束后使混合物降到适当温度，加入适量的4%NaOH溶液调节至所需pH，然后加入200 g/L的水以及适量的酶液，在10 000 r/min搅拌速度下充分混匀后，于所需条件下进行反应。反应结束后在90 ℃条件下加热10 min使酶失活，然后12 000 r/min离心10 min，取上层油样进行磷含量和甘油二酯含量的测定。

磷含量测定参照GB/T 5537—2008；甘油二酯含量测定则按照AOCS官方方法Cd 11d-96。

1.6.2 油相pH的测定

准确称取40 g经过柠檬酸预处理的油水混合物于50 mL离心管中，在5 000 r/min转速下离心10 min，去掉上层油相，然后向离心管中加入5 mL水，充分混匀后再次5 000 r/min离心10 min，取水相进行pH测定。最终所测油相pH的经验校正公式：实际pH=测量pH-0.3[20]。

1.6.3 不同脱胶条件对PC-PLC与PI-PLC脱胶效果的影响

在脱胶试验中，分别考察不同的脱胶温度、pH、酶添加量和反应时间对PC-PLC与PI-PLC单独使用脱胶效果的影响，以脱胶油中磷含量作为考察指标。每组实验进行3次平行实验，取3次结果平均值作为最终结果。

1.6.4 PC-PLC与PI-PLC联合脱胶效果的研究

由于油脂中磷脂的主要成分是PA、PC、PE和PI，单独使用PC-PLC或PI-PLC用于油脂脱胶，脱胶效果很难达到物理精炼的要求。因此，本实验将PC-PLC和PI-PLC联合用于脱胶试验中的脱胶效果进行研究。

2 结果与讨论

2.1 PC-PLC和PI-PLC在枯草芽孢杆菌中的克隆表达结果

根据PC-PLC的基因序列设计引物，将PCR产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳结果见图1。

由图1可知：在近900 bp处有特异性扩增条带，其大小与预期基本一致(目的条带约为852 bp)。挑取阳性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，测序结果与GenBank中目的序列一致。重组菌B.sublitis/PMA5-PCPLC以及B.sublitis/PMA5-PIPLC表达蛋白的SDS-PAGE电泳见图2。

由图2可知，PC-PLC和PI-PLC表达的重组蛋白与预测的酶蛋白分子量基本一致(PC-PLC约为3.0×104，PI-PLC约为3.2×104)。将发酵所得上清分别经过硫酸铵分级沉淀和透析袋除盐后用Bradford法测定粗酶液蛋白浓度，所测得PC-PLC和PI-PLC粗酶液蛋白质量浓度分别为0.8 mg/mL和0.5 mg/mL。

M为标准DNA；1为PC-PLC的PCR结果图1 PC-PLC基因PCR结果Fig.1 PCR analysis of PC-PLC

M为标准蛋白；1为PI-PLC；2为PC-PLC；3为WB800空菌对照图2 PC-PLC和PI-PLC表达结果Fig.2 SDS-PAGE analysis of PC-PLC and PI-PLC

2.2 PC-PLC和PI-PLC粗酶液酶学性质研究结果

2.2.1 最适温度和温度稳定性

PC-PLC和PI-PLC最适温度和温度稳定性见图3。

由图3可知：PC-PLC和PI-PLC的最适温度分别为45 ℃和40 ℃，并且这2种酶在30～50 ℃范围内酶活均能达到60%以上。

在30～45 ℃范围内保温2 h后，PC-PLC和PI-PLC都能保持60%以上活性。说明这2种酶的温度稳定性较好，有应用价值。

图3 温度对PC-PLC和PI-PLC活性和稳定性影响Fig.3 Effects of temperature on activity and stability of PC-PLC and PI-PLC

2.2.2 最适pH和pH稳定性

PC-PLC和PI-PLC最适pH和pH稳定性见图4。

图4 pH对PC-PLC和PI-PLC活性和稳定性影响Fig.4 Effects of pH on activity and stability of PC-PLC and PI-PLC

由图4可以看到，这2种酶的最适pH分别为6.0和7.0。在pH为6.0～7.0时，2种酶的稳定性都较好，2 h后剩余酶活仍在60%以上。当pH超过7.0，酶的稳定性下降比较明显，而在偏酸性条件下酶活稳定性较好，说明这2种磷脂酶在中性偏酸的条件下有较好的耐受性。

2.2.3 金属离子对酶活力影响研究

金属离子对PC-PLC和PI-PLC酶活性影响结果见图5。

由图5可知：Mg2+和Zn2+对PC-PLC活性有较大的促进作用；而Ca2+则对PI-PLC活性有较大促进作用，Mg2+同样对其活性有促进作用，但不如Ca2+明显。其余金属离子对PC-PLC和PI-PLC的促进或抑制作用均不是很显著。

图5 金属离子对PC-PLC和PI-PLC酶活的影响Fig.5 Effects of metal ions on activity of PC-PLC and PI-PLC

2.3 PC-PLC和PI-PLC在不同条件下脱胶效果研究

2.3.1 温度对脱胶效果影响

在脱胶过程中，温度的高低对脱胶效果有着重要的影响。在pH 6.5、酶添加量60 mg/kg和反应2 h条件下分别对PC-PLC和PI-PLC在40、45、50、55、60和65 ℃温度下的脱胶效果进行研究，结果如图6所示。

图6 温度对脱胶的影响Fig.6 Effects of temperature on degumming

从图6(a)可以看出，当温度在40～50 ℃之间时，随着温度升高，脱胶油中磷含量随之降低；而当温度高于50 ℃，磷含量逐渐升高，可能是由于温度的升高导致酶活性逐渐下降，从而降低脱胶效果，PC-PLC的最佳脱胶温度为50 ℃。图6(b)表明PI-PLC在温度为45 ℃时脱胶效果最佳，当温度高于45 ℃，随着温度的上升，脱胶油中磷含量也在增加。由此可见，PC-PLC的最佳脱胶温度高于PI-PLC的最佳脱胶温度

2.3.2 pH对脱胶效果影响

pH在脱胶过程中也是1个十分重要的影响因素。在45 ℃、酶添加量60 mg/kg、反应2 h条件下分别考察PC-PLC和PI-PLC在pH 4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0条件下的脱胶效果，结果如图7所示。

从图7可以看到，PC-PLC和PI-PLC的最佳脱胶pH分别为6.0和7.0，与它们的最适pH及pH稳定性结果基本一致。PC-PLC与PI-PLC在pH 6.0～7.0范围内的脱胶效果均较好，而在该范围之外的pH条件下，脱胶油中磷含量则开始上升，说明过酸或者过碱条件均不利于这2个酶的脱胶反应。

图7 pH对脱胶的影响Fig.7 Effects of pH on degumming

2.3.3 酶添加量对脱胶效果影响

在脱胶试验中，酶添加量过高会形成酶的过量，造成酶浪费；而酶添加量过低则会使的脱胶效果不佳。因此，需要对酶添加量进行优化。本实验在45 ℃、pH 6.5、反应2 h条件下，分别在脱胶体系中添加20、40、60、80、100和120 mg/kg的酶量，考察不同酶添加量条件下的脱胶效果，结果如图8所示。

图8 酶添加量对脱胶的影响Fig.8 Effects of enzyme dosage on degumming

由图8可以发现:随着脱胶体系中初始酶量增加，脱胶油中磷含量降低幅度较大；当PC-PLC添加量达到80 mg/kg时，继续增加酶量，磷含量降低十分缓慢，基本保持不变，说明在80 mg/kg的酶添加量情况下，油脂中PC和PE基本被完全水解。而PI-PLC的添加量在超过60 mg/kg后脱胶油中磷含量就基本保持不变，说明在该酶量添加条件下油脂中PI基本被水解完全。考虑到酶的成本的原因，PC-PLC和PIP-PLC分别选择80 mg/kg和60 mg/kg的酶添加量为最佳添加量。

2.3.4 反应时间对脱胶效果的影响

在pH 6.5、45 ℃、酶添加量为60 mg/kg油的条件下，分别考察不同脱胶时间(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h)对PC-PLC和PI-PLC脱胶效果的影响，结果见图9。

图9 反应时间对脱胶的影响Fig.9 Effects of reactiontime on degumming

由图9可知：在脱胶时间为0～1 h时，磷含量急剧下降，这是由于对油脂进行酸的预处理过程中，柠檬酸将油脂中的一些非水化磷脂转化成水化磷脂，而水化磷脂具有相对较好的水化作用，在后续的离心过程中存在于水相从而被去除。当反应时间超过2 h后，磷含量的降低极为缓慢，2.5 h后脱胶油中磷含量基本保持不变，考虑到2h基本上水解过程达到平衡且反应时间延长会造成生产成本的增加，因此，选择2 h为最佳脱胶反应时间。

综上所述，得到PC-PLC的最适脱胶条件为50 ℃、pH 6.0、反应2 h、酶添加量为80 mg/kg；PI-PLC的最适脱胶条件为45 ℃、pH 7.0、反应2 h、酶添加量为60 mg/kg。

2.4 PI-PLC与PC-PLC组合使用脱胶效果

根据2.3节不同条件对PC-PLC和PI-PLC脱胶效果的影响的结果设计如下几组实验方案来比较联合使用用于处理大豆毛油的脱胶效果，每组试验进行3次平行实验，取3次实验平均值作为最终结果。实验方案及结果见表1。

由表1可以看出：在对大豆毛油进行脱胶试验中，PC-PLC与PI-PLC联合使用可以达到很好的脱胶效果，脱胶后的磷含量除4号实验都达到了物理精炼要求，而单酶脱胶效果则没能达到要求；在1号实验条件下最终磷质量分数为4.1 mg/kg，在对油脂中甘油二酯变化量进行测定后发现甘油二酯增加量达到0.95%。对比4组组合实验脱胶结果，发现在1号条件(PC-PLC最适脱胶条件)下脱胶效果最好，这可能是因为油脂中PC、PE的含量大于PI含量，所以在PC-PLC最适脱胶条件脱胶效果要优于其他条件。

表1 不同脱胶条件下磷含量和甘油二酯增加量

3 结论

笔者成功将分别具有PC、PE特异性和PI特异性的磷脂酶C基因克隆至枯草芽孢杆菌WB800并进行胞外分泌表达。对PC-PLC和PI-PLC粗酶液进行了酶学性质研究，包括最适温度和温度的稳定性、最适pH和pH稳定性、金属离子的影响。结果发现这2种磷脂酶C均具有较好的温度和pH耐受性。其中PC-PLC和PI-PLC最适温度分别为45 ℃和40 ℃，并且在30～45 ℃范围内保温2 h后剩余酶活仍在60%以上；PC-PLC和PI-PLC最适pH分别为6.0和7.0，在pH为6.0～7.0时，2种酶都具有较高的稳定性，保温2h后剩余酶活在60%以上。金属离子影响研究中发现Mg2+和Zn2+对PC-PLC活性有较大的促进作用；而Ca2+则对PI-PLC活性有较大促进作用。

在进行的植物油脱胶研究实验中发现不同的反应温度、pH、反应时间和酶添加量对脱胶效果影响也不同。在将PC-PLC和PI-PLC组合，共同用于油脂脱胶中发现，该组合脱胶效果相较于单个酶使用效果有很大的提升，在50 ℃、pH 6.0、反应2 h、PC-PLC和PI-PLC初始粗酶液添加量分别为80 mg/kg和60 mg/kg时，脱胶油中磷质量分数降至4.1 mg/kg，完全达到后续物理精炼所需要求，并且油脂得率增加0.95%。以上这些研究为磷脂酶C在油脂脱胶领域做出了新的探索，并为以后工业化应用提供了数据基础。