犬源弗氏柠檬酸杆菌的分离与鉴定

张希墨，陆璐，刘燕霏，杨建德

（天津农学院 动物科学与动物医学学院，天津300384）

弗氏柠檬酸杆菌隶属肠杆菌科（Enterobacteriaceae）枸橼酸杆菌属（Citrobacter），为该属的代表种，常与动物和人的感染有关。该菌为革兰氏阴性短杆菌[1]，需氧或兼性厌氧，广泛存在于水体及土壤中[2]，是人和动物（哺乳类、鸟类、爬行类及两栖类）肠道内正常的菌群，属于条件致病菌[3-4]，感染致病性弗氏柠檬酸杆菌后可引起动物和人腹泻、肺炎、败血症及食物中毒等症状，某些毒力很强的菌株可引发人和动物患脑膜炎、脑脓肿等病症[5]。近年来，由于抗生素的滥用导致柠檬酸杆菌的耐药性日益严重[6]，其危害性有加重的趋势，尤其是在医疗机构，其已成为感染常见病原之一[7]。本研究对1例犬子宫蓄脓脓汁细菌分离，经形态学观察、生化试验及基因序列分析鉴定为弗氏柠檬酸杆菌。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

普通营养琼脂平板、麦康凯培养基及各种糖发酵管购自杭州生物研究所；药敏片购自杭州微生物试剂公司；Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒、Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒、Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒、Dream Taq-TM DNA Polymease、琼脂糖购自BBI；SanPrep柱式DNAJ胶回收试剂盒及DNA Ladder Mix maker购自生工生物（上海）有限公司；引物由生工生物（上海）有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离和培养

无菌采集患子宫蓄脓犬的子宫分泌物。取少量脓汁接种在普通营养琼脂平板及麦康凯琼脂平板上，37 ℃恒温箱中培养24 h，根据不同菌落的形态特征，分别挑取单个菌落进行纯化，并将纯化后的菌种4 ℃保存待用。

1.2.2 细菌形态学观察

分别观察纯培养物在普通营养琼脂平板和麦康凯琼脂平板上的菌落特性及其生长表现。取分离的纯培养菌进行革兰氏染色，观察其染色、形态与排列特征。

1.2.3 细菌生理生化试验

将分离纯化的细菌分别无菌接种到甘醇、尿素、麦芽糖、乳糖、蔗糖、半糖、葡萄糖、葡萄糖磷酸、枸橼酸盐等11种发酵管，37 ℃培养24～48 h，记录结果。

1.2.4 细菌药敏试验

采用圆纸片法对分离菌进行药物敏感性试验。药敏片药物含量见表2，37 ℃培养18～24 h，观察并记录抑菌圈的大小，分析其药物敏感情况。

1.2.5 分离菌株16S rRNA基因的扩增、测序与分析

按照SK8255（细菌）说明书对分离菌株的16S rRNA进行PCR扩增，预扩增条带为1 500 bp。扩增体系为: Template（基因组DNA 20-5 ng/μL）0.5 μL，10×buffer（Mg2＋plus）2.5 μL，DNTP（各2.5 mmol/L）1 μL，Taq酶0.2 μL，F（10 μmol/L）0.5 μL，R（10 μmol/L）0.5 μL，加双蒸水至25 μL，PCR 反应条件: 94 ℃预变性4 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环，最后72 ℃再延伸10 min, 4 ℃终止反应。使用1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司纯化、测序。测序引物为，S1: 5＇-GAGAGTTTGATCCTGGCT-3＇；S2: 5＇-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3＇。

1.2.6 分离菌株16S rRNA基因同源性分析与进化树构建

将菌株的 16S rRNA 基因序列在NCBI核苷酸数据库上进行BLAST比对，获取与分离菌株16S rRNA基因序列最为相近的序列。采用DNAStar 软件进行多序列同源性比对、分析，并构建系统进化树。

2 结果

2.1 分离菌的生物学特性

分离菌在普通营养琼脂培养基上菌落呈中等大小、圆形、表面湿润、光滑、边缘整齐、半透明、生长良好的灰白色（图1）；在麦康凯琼脂培养基上形成圆形光滑、稍隆起、边缘整齐的红色菌落（图2）。革兰氏染色阴性杆菌，单个或成对随机排列、无芽孢、无荚膜、两端钝圆（图3）。

图1 营养琼脂上分离菌菌落状态

图2 麦康凯琼脂上分离菌菌落状态

图3 革兰氏染色镜检

2.2 生化试验结果

葡萄糖、麦芽糖、硫化氢、葡萄糖磷酸、乳糖、甘醇和靛基质试验为阳性；蔗糖、尿素、半糖和枸橼酸盐试验为阴性，该分离菌的生物学特性及生化试验结果符合《常见细菌系统鉴定手册》中柠檬酸杆菌的特征，见表1。

表1 分离菌生化特性试验结果

2.3 抗生素药敏试验

由表2看出，该细菌对氨卞西林、麦迪霉素、派拉西林耐药；对氨曲南、头孢噻吩、头孢噻肟、卡那霉素中度敏感，对头孢唑林、头孢呋辛、头孢哌酮、头孢曲松、头孢吡肟、头孢西叮、头孢他啶、氧氟沙星、链霉素、妥布霉素敏感。

表2 分离菌株药敏试验结果

2.4 16S rRNA 基因同源性分析

将此序列在NCBI网站上进行BLAST对比，与柠檬酸杆菌的相似性最高，将分离菌株的16S rRNA序列经DNAstar软件中的MegAlign分别与10株数据库中的序列进行进化树构建，结果见图4，系统进化树表明本试验所获的菌株Citrobacter freundii与KF953995.1、KF953996.1亲缘关系最近，而与KU570332.1、KU57034.1亲缘性较远。同源性均为99%以上。

图4 分离菌16S rRNA 基因序列与参考序列进化树分析结果

3 讨论与分析

弗氏柠檬酸杆菌属于肠杆菌科，是人类及动物肠道内的正常菌群，并且也普遍分布在自然界中，是条件致病菌，可能引起严重的肠道炎、尿道感染和呼吸道感染[7-9]。在2011年，刘广义[10]从医院临床标本分离出156株弗氏柠檬酸杆菌，检出弗氏柠檬酸菌的分布规律及耐药性特点，发现该菌在临床感染上占优势地位，以呼吸疾病为多。，2012年，徐文必等[6]对36例子宫蓄脓进行了细菌分离鉴定，其中有24株大肠杆菌、9株金黄色葡萄球菌和3株疑似棒状杆菌。犬子宫蓄脓是中老年母犬的常见病，犬子宫蓄脓的发病主要是由生殖激素和细菌感染双重引起的。影响犬子宫蓄脓的病原有多种，如大肠杆菌、链球菌、葡萄球菌、李氏杆菌等[8]，但是由弗氏柠檬酸杆菌导致犬感染发病的报道很少。本次研究通过对犬子宫蓄脓的脓汁分离培养、形态学观察、生化试验和16S rRNA基因序列分析，鉴定为弗氏柠檬酸杆菌，在子宫蓄脓病例中尚属首次。

近年来，关于弗氏柠檬酸杆菌耐药性的报道不断增多，王利等[11]检测鲤鱼弗氏柠檬酸杆菌的耐药表型及耐药基因，结果表明弗氏柠檬酸杆菌对氨卞西林、头孢拉定耐药；曹朕娇[12]报道弗氏柠檬酸杆菌对β-内酰胺类抗生素以及喹诺酮类抗生素产生完全耐药性。经过药敏试验测定，本次分离菌对氨卞西林和麦迪霉素耐药，对头孢哌酮、头孢曲松等高度敏感，与上述文献报道的耐药性有所差异，分析原因可能与该犬生活环境有关。由于弗氏柠檬酸杆菌日趋严重的耐药现象以及对人类健康潜在的威胁[13-16]，应加强其耐药性监测、加强抗生素的合理使用以控制耐药株的流行。