实验动物布鲁杆菌PCR检测方法团体标准的编制

冯育芳，邢 进，张雪青，王 洪，李晓波，岳秉飞

(中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所，北京 100050)

布鲁杆菌(Brucella)为革兰阴性的多形性球杆菌，无荚膜、鞭毛、芽孢及天然质粒，目前主要有6个种19个生物型，其中猪、牛、羊、犬种均可感染人，是重要的人畜共患病病原之一，该菌分离培养困难，血清学检测方法存在特异性差、抗原难以制备等问题，急需制定新的实验动物布鲁杆菌检测方法和标准。基于此，我们建立了实验动物布鲁杆菌PCR检测标准，本文对标准进行了详细解读。

1 编制背景

布鲁杆菌是一种细胞内寄生的小球杆状菌，可自然感染实验犬等动物[1]，导致流产、不孕、睾丸炎等症状，降低实验动物产量[2]，并威胁饲养人员和实验人员的健康[3-4]，如东北农大就发生了布鲁杆菌感染事件[5]，引起政府和社会的广泛关注[6]。为遏制布鲁杆菌对实验动物的影响，确保公共卫生安全，加强对实验动物布鲁杆菌的综合防治和净化工作就显得尤为重要。欧盟实验动物科学联合会和世界动物卫生组织等已将该菌列为动物排除病原。我国实验动物国标(GB14922.2-2001)也明确实验犬必需排除布鲁杆菌的感染。

布鲁杆菌的特异性诊断方法包括病原鉴定和血清学试验[7-9]。其中，常用方法是血清凝集试验、试管凝集、及ELISA方法[10]。现行国家标准(GB/T 14926.45-2001)中规定实验动物布鲁杆菌检测用的方法是试管凝集。而试管凝集需要使用大量的布鲁杆菌抗原，该抗原的生产需要生物安全三级(BSL-3)及以上的特殊实验室和布鲁杆菌菌种，但大多数实验室无法获得布鲁杆菌菌种，无法自行培养布鲁杆菌，并获得布氏抗原[11]。以前销售试管凝集抗原的厂家也以不再供应该产品，所以实验动物布鲁杆菌检测遇到了无法解决的瓶颈问题[7]。为此，我们需要寻求一种更加简便的、适用于大部分实验室的实验动物布鲁杆菌检测方法。

为选择合适的方法用于实验动物的布鲁杆菌检测，我们分析了国内外动物布鲁杆菌检测的相关标准和文献[12-14]，发现多重PCR方法不需要培养活菌，大大减少了实验室感染的可能性，也不需要使用布氏抗原，同时可以检测布鲁杆菌的多种型别，以减少漏检的发生，因此，多重PCR方法成为实验动物布鲁杆菌检测的较为合适的方法；鉴于其实用性和广适性，该方法也适合收录到实验动物团体标准，推广供各单位参考使用。

2 法规依据

依据质检总局、国家标准委、民政部于2017年底发布的《团体标准管理规定(试行)》的相关规定，团体标准是依法成立的社会团体为满足市场和创新需要，协调相关市场主体共同制定的标准。团体标准的编写参照GB/T 1.1《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的规定执行。《实验动物布鲁杆菌PCR检测方法团体标准》的制定均严格遵照该规定的要求执行。

本标准收集、整理了国内外有关组织、地方和实验动物专业生产公司的实验动物布鲁杆菌检测的先进标准，在研究分析质量标准和控制要求的异同点后，在我国现有的实验动物微生物质量控制研究基础之上制定。在确定本标准各项指标时，以《实验动物管理条例》和《实验动物质量管理办法》为依据，同时参考了国家标准《实验动物 微生物学等级及监测》、《实验动物 微生物学检测方法》、《实验动物 细菌学检测 染色法、培养基和试剂》和《动物布鲁氏菌病诊断技术》，商检行业推荐性标准《布氏杆菌检疫技术规范》，以及国际公认的具有权威性的资料如FELASA及世界动物卫生组织(OIE)等资料，使本标准的各项指标与国际水平接轨，符合国家标准的要求，使标准具有一定的可操作性和广适性。

3 内容编制

3.1 适用范围

基于感染情况调查及实验研究数据，实验动物常感染牛种、猪种、犬种、羊种、绵羊种和沙林鼠种布鲁杆菌。为此，本标准适用于牛种、猪种、犬种、羊种、绵羊种和沙林鼠种布鲁杆菌感染的动物检测。

3.2 检测程序

检测程序如图1所示。

3.3 操作步骤

按照国家标准《实验动物细菌学检测标本采集》，采取EDTA抗凝血、流产胎盘、胎膜、精液、奶、关节液和水囊瘤液等样本。使用商品化试剂盒提取细菌DNA，菌液可直接提取，样本需进行研磨处理，具体提取步骤参照试剂盒使用说明。建立PCR反应体系(见表1)，PCR反应条件为：94℃ 5min；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 2min，重复35个循环；72℃ 7min。

如果多重PCR扩增结果相同，则用限制性内切酶对910 bp片段进行组合酶切，酶切反应体系及条件参照限制性内切酶说明书，KpnI只能切开沙林鼠种(690)和羊种(712)，在猪型上没有酶切位点；EcoRI在沙林鼠种上的酶切位点是458，在另两型上有两个酶切位点，分别是猪种(450，652)，羊种(243，455)，见表2。利用组合酶切的方式可以区分沙林鼠种、猪种和羊种。

如条件允许，可将PCR产物送公司进行测序，并进行序列比对。当阳性对照出现相对应目的条带，以及阴性空白对照无条带时，检测结果有效，对结果进行判读。待检样品出现相应条带时，如果难以区分是哪个种的布氏，需进行酶切鉴定；可疑样品PCR产物需送公司进行测序；当测序结果和PCR结果都确定为布鲁杆菌时，判定为布鲁杆菌阳性结果。

图1 检测程序Figure 1 Detection procedure

表1 PCR反应体系

表2 不同种布鲁杆菌PCR产物(910 bp)的酶切片段

4 未来展望

布鲁杆菌的检出要求犬厂家对阳性犬进行扑杀，基于福利伦理以及经济价值的考虑，我们判断结果都需要慎重再慎重，所以对于阳性结果的判断我们不能仅仅依赖一种方法，需要用其他的方法去验证，布鲁杆菌的分子检测方法可以有效弥补血清学检测方法特异性略差的问题，对结果的判断可以更为准确，因此，该方法可以作为国标布鲁杆菌检测方法的验证方法纳入团体标准的范围。

此外，随着实验动物科学的发展，实验动物质量标准要求的越来越高，团体标准转化为国家标准或地方标准势在必行，将成熟的经实践检验过的团体标准转化为实验动物的国家标准，也是促进我们的国家标准与国际接轨，提高我国实验动物质量整体水平的必然要求。

当然，随着病原检测技术的不断进步，本团体标准也将在未来的实施和实践中也会不断的改进和提高；特别是，其他领域的标准及国际标准中的布鲁杆菌诊断方法要比实验动物国家标准中规定的布鲁杆菌的检测方法全面，我们也需要不断的补充完善实验动物布鲁杆菌检测方法和检测标准，努力提升实验动物质量，从而保障药品质量评价和人民群众的身体健康。