实验动物SPF鸡质量控制标准介绍

韩凌霞，孟 兴，佟相慧，陈洪岩

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物与比较医学创新团队，黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室，哈尔滨150069)

无特定病原体(SPF)鸡是指人工培育，遗传背景或来源清楚，携带病原微生物清晰，用于科学研究、教学、生物制品检定的实验动物，是我国目前唯一的陆禽类实验动物。我国从上世纪80年代末开始SPF鸡培育，经历一个快速发展时期后，育种单位从少数国有单位逐渐转向企业和科研院所并重，种源也出现多源化。科技部在2008年组织专家评审，将“国家禽类实验动物种子中心”依托于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，主要承担SPF禽培育、保种、供种和服务工作。SPF鸡作为禽类实验动物的代表，在禽病学和比较医学研究中的比重日益增大，2009年至2014年被美国国立生物技术信息中心(NCBI)收录的以禽为实验动物的病原微生物感染试验研究报告有247篇，涉及致病性或基因工程病毒、细菌、体表寄生虫或原虫等多种病原体的体内感染实验[1]。SPF鸡胚是人用疫苗(小儿麻疹、腮腺炎、黄热病、狂犬病和流感)、全部鸡病疫苗和部分水禽疫苗，以及部分猪用疫苗(伪狂犬病等)的生产和检定实验材料。《中华人民共和国兽药典》(2015年版)明确规定：“用于兽用生物制品生产与检验的实验动物中，用于禽类制品菌、毒种的制备与鉴定，病毒活疫苗生产与检验，灭活疫苗的检验，用鸡、鸡胚应符合国家无特定病原体(SPF鸡)动物标准。生产用禽源原代细胞应来自健康家禽(鸡为SPF级)的正常组织”[2]。2015年我国有10个省(自治区、直辖市)生产鸡胚，其中SPF鸡胚生产量达4283.55万枚，占总产量的84%[3]。SPF鸡的质量直接关乎人类健康和公共生物安全。

SPF鸡的质量不仅指病原微生物排除的情况，还包含遗传学、环境设施和饲料质量，以及饲养管理工艺。自1999年国家质量技术监督局发布首个SPF鸡质量标准“GB/T 17998-1999 SPF鸡微生物学监测总则”以来，至2018年1月1日中国实验动物学会实施“T/CALAS 38-2017实验动物SPF鸡和SPF鸭饲养管理指南”，目前正在实施的与SPF鸡质量控制直接相关的标准有14个：包括微生物学标准10项、遗传学质量1项、饲养管理2项和运输装备1项，涉及国标、地标、团标和企业标准，本文将就这些标准做一简单介绍。

1 微生物学质量标准

微生物学质量是SPF鸡群培育和管理的基本要求。国际上对SPF鸡群的疫病监测种类并没有统一标准。2008年12月31日，由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局和中国国家标准化管理委员会联合发布了SPF鸡微生物学监测标准 “GB/T 17999.1—2008 SPF鸡微生物学监测第1部分：SPF鸡微生物学监测总则”[4]，该标准定义了SPF鸡的概念，规定了SPF鸡的微生物学监测项目及其检测技术，包括检测样品、检测项目、检测程序、检测规则、结果判定和检测报告等，适用于SPF鸡和SPF鸡蛋病原微生物感染的监测。为规范检测采样，提出了术语“饲养单元”，即相同饲养环境下的最小鸡饲养设施，如一台鸡饲养隔离器或屏障环境的一个饲养房间。同时公布了9个配套的检测技术标准，分别是“GB/T 17999.2—2008 SPF鸡微生物学监测第2部分：SPF鸡红细胞凝集抑制试验”、“GB/T 17999.3—2008 SPF鸡微生物学监测第3部分：SPF鸡血清中和试验”、“GB/T 17999.4—2008 SPF鸡微生物学监测第4部分：SPF鸡血清平板凝集试验”、“GB/T 17999.5—2008 SPF鸡微生物学监测第5部分：SPF鸡琼脂扩散试验”、“GB/T 17999.6—2008 SPF鸡微生物学监测第6部分：SPF鸡酶联免疫吸附试验”、“GB/T 17999.7—2008 SPF鸡微生物学监测第7部分：SPF鸡胚敏感试验”、“GB/T 17999.8—2008 SPF鸡微生物学监测第8部分：SPF鸡鸡白痢沙门氏菌检验”、“GB/T 17999.9—2008 SPF鸡微生物学监测第9部分：SPF鸡试管凝集试验”和“GB/T 17999.10—2008 SPF鸡微生物学监测 第10部分：SPF鸡间接免疫荧光试验”等9项。

美国的SPF鸡产生企业查理河(Charles River)公司是个跨国公司，公司按照现行欧盟药典5.2.2和美国农业部备忘录800.65批准的检测方法制定SPF鸡群的饲养和检测企业标准。规定从4周龄开始，每周对每个鸡群检测，共列出了32种病原微生物，分为3个级别：“保险级”(Premium)， 符合美国农业部的规定，排除特定病原体，但不排除鸡传染性贫血病毒(CAV)；优先级(Premium Plus)，符合欧盟药典要求，排除特定病原体，CAV阴性；“研究级”(Research)，指对各种禽白血病病毒亚群没有抗性，不含内源性禽白血病。其中15种微生物推荐首选用多重荧光免疫技术(MFIA)检测，3种首选用ELSIA[5]。首次监测从8～10周龄开始，每隔4～8周，监测规定的项目。有疑似病原微生物感染危险时，必须第一时间进行特定病原检测，采样组织根据疫病的流行病学和致病机制灵活决定。我国国标规定排除19种病原微生物的种类，未明确规定各项微生物的检测用毒株或菌株，在推荐使用的检测方法中，有6种首选ELISA，5种首选琼脂扩散试验(AGP)。但由于部分鸡病AGP检测用合法抗原缺乏，实际检测时往往采用商品化的ELISA试剂盒，对被检鸡群进行血清学普查。美国查理河公司与中国国标规定的SPF鸡监测项目及其检测方法的比较见表1。

(续表1)

注：√：表示与第2列“微生物或疫病”相同；-：表示未涉及；AGP：琼脂扩散试验；MFIA：多重荧光免疫； HI：血凝抑制试验；SPA：血清平板凝集试验，EST：胚敏感试验；IA：病原体分离；SN：血清中和试验；IFA：间接免疫荧光试验；ELlSA：酶联免疫吸附试验；TA：试管凝集试验；CO：临床观察；RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应；PCR：聚合酶链式反应。

Note：√means the same as the Line 2 “Microbes or diseases”; -: means not involved; AGP: agar gel precipitation; MFIA: multiplexed fluorescence immunoassay; HI: hemagglutination inhibition test; SPA: serum plate agglutination test; EST: embryo susceptibility test; IA: isolating assay; SN: serum neutralization test; ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay; TA: tube agglutination test; CO: clinical observation; RT-PCR: reverse transcription-polymerase chain reaction; PCR: polymerase chain reaction.

2 遗传学质量标准

实验禽类种质资源相对于畜牧业养禽业种质来说很少，国内外SPF鸡均以产白壳蛋的轻型蛋鸡白来航鸡为主要血统。国内SPF鸡场习惯于从国外引进种卵，但供应商以商业机密为由对种源的遗传结构或分子遗传背景概无奉告。笔者的国际合作伙伴曾透露某国际著名SPF鸡供种公司对外供给的SPF鸡多为疫病抗性品系，虽理论上可能降低生产过程中微生物污染的危害，但同时也会降低疫苗种毒病毒的产量，间接增加生产成本，或者导致疫病感染模型不理想甚至失败，或者由于来源不同而导致实验结果重复性差。各自为政下的盲目重复引种不仅耗费了大量外汇，而且使国内SPF鸡群遗传学质量鱼龙混杂。

早在1994年广东省即出台标准“DB44/60-94实验动物啮齿类和鸡的遗传”，规定“鸡的近交系是指兄妹连续交配11代以上育成的品系，近交系数90%以上”。实践中，由于主要组织相容性复合体(MHC)是脊椎动物基因组中紧密连锁、高度多态的基因簇，其多态性不仅影响宿主对多种特定疫病的敏感性[6-7]和对疫苗制品的产量[8]，甚至与产蛋性能相关[9]，因此生产用的SPF近交系鸡少见报道，而MHC单倍型成为国内外分子标记鸡育种的方向。国外已培育成功大量MHC单倍型鸡[10-11]，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所以国内培育品种BWEL-SPF鸡为基础培育成功4个MHC单倍型鸡[12]，与国际公认的14种高基因型频率的B单倍型[13]遗传学特征符合[14-15]。

我国现行实验动物遗传学质量国家标准“GB14923—2010实验动物哺乳类实验动物的遗传质量控制”、“GB/T 14927.1—2008 近交系小鼠、大鼠生化位点检测方法”和“GB/T 14927.2—2008近交系小鼠、大鼠免疫标记检测方法”明确规定适用于哺乳类实验动物的遗传分类、命名、繁殖及近交系小鼠、大鼠的遗传纯度检测[16]，不适用于禽类。

2017年5月19日，中国实验动物学会发布了团体标准“T/CALAS 16-2017实验动物SPF鸡遗传质量控制”，规定了SPF鸡的繁殖和遗传质量监测方法，适用于封闭群和MHC单倍型鸡群的遗传质量控制，内容包括封闭群鸡和MHC单倍型鸡的繁殖方式和遗传学检测技术。封闭群的群体遗传结构检测采用了世界粮农组织推荐的15个微卫星分子标记，表明适合于SPF鸡群的检测[17]。规定封闭群繁殖的原则应尽量保持基因异质性及多态性，避免近交系数随繁殖代数增加而过快上升，各家系之间采用最佳避免近交法每代近交系数上升不超过1%。种公鸡与种母鸡数量比例一般为1∶8～10。种群规模不大于100羽的，随机抽样25个体，雌雄不限，100只以上按15%抽样。MHC单倍型鸡种群采取全同胞或半同胞兄妹交配，保持MHC核心区域的基因纯合性。全群监测。在连续2个世代未出现杂合的情况下，各单倍型种群规模不大于100羽的按20%的比例抽样，大于100只的按25%抽样，雌雄、日龄不限。采用聚合酶链式反应(PCR)针对MHC核心区域的2个片段进行基因组核酸扩增和序列比对。所有样本序列与国际标准序列同源性达100%，判为合格。若出现杂合个体，则对全群检测，淘汰所有杂合个体。每个世代种鸡都应进行遗传学质量检测。

3 配合饲料标准

SPF鸡的饲育的目的是在无病原微生物污染的前提下生产无疫病抗体、无抗生素残留、活性强的受精卵，生产实践中往往存栏一到两个产蛋周期，而商品化蛋鸡养殖场以高产蛋率为宗旨——这种差异导致对配合饲料的质量要求成为生产SPF鸡的最大成本来源：(1)SPF鸡的饲料必须是全价料，不得添加任何抗生素、激素类添加剂；(2)饮水为酸化水；(3)批生产量远小于商品蛋鸡场；(4)必须经过高压灭菌或放射线辐照等不同形式的灭菌工艺；(5)肠道菌群与普通鸡消化道有较大差异[18]，饲料转化率低。

生产阶段划分越细，意味着配合饲料种类越多，单品种饲料生产批次量越低，加工环节对微量元素含量、保质期等的控制误差就越大。美国LabDiet公司将实验用鸡的饲喂阶段划分为育雏育成和产蛋两个阶段，但育雏期生长较快，对能量和蛋白质的需要量均高于育成期，易导致鸡生长过快，造成肥胖，影响产蛋量；产蛋前期和高峰期对钙的需求差别极大，也不宜划分为同一时期。澳大利亚将SPF鸡的饲料标准分为幼雏(0～6周龄)、中雏(6～20周龄)和成鸡(20周龄以上)，只简单规定了粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、食盐、维生素A和维生素D的含量[19]。

2017年5月中国实验动物学会发布的团体标准“T/CALAS 15-2017实验动物SPF鸡配合饲料”适用于SPF鸡的配合饲料的质量控制，规定了SPF鸡配合饲料的质量要求、营养成分测定要求、卫生要求、检测规则以及标签、包装、贮存和运输要求。将SPF鸡划分为育雏期(0～8周龄)、育成期(9～18周龄)、产蛋前期(19～24周龄)和产蛋高峰期(25周龄以上，至产蛋量下降为5%)，规定了常规营养成分(水分、代谢能、粗蛋白、钙、总磷、钠和亚油酸)、12种氨基酸(赖氨酸、蛋氨酸、蛋氨酸/胱氨酸、精氨酸、组氨酸、苏氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)、13种维生素(视黄醇(A)、胆钙化醇(D3)、生育酚(E)、维生素K、维生素B1、核黄素(B2)、泛酸(B5)、烟酸(B3)、钴胺素(B12)、胆碱、生物素、叶酸(B9)和吡哆醇(B6))以及6种微量矿物元素(锰、锌、铁、铜、碘和硒)等指标的最低值[19]。

根据“GB 14924.2-2001实验动物配合饲料卫生标准”，实验动物配合饲料应进行灭菌处理，常用的有60Co辐照灭菌和高温高压蒸汽灭菌等。高压蒸汽灭菌较为彻底，但是对营养成分破坏较大，尤其是一些热敏成分，如维生素VA、VB1、VB2和VB6等，粗蛋白的含量降低8%。辐照灭菌的优点是在灭菌过程中几乎不发生热交换，对于SPF鸡用饲料60Co辐照的灭菌剂量，国内外大多数国家采用25 kGy。据研究，用25 kGy辐照灭菌的饲料可以保存120 d，而用20 kGy辐照灭菌的饲料只能保存60 d。水分、粗蛋白、粗纤维和粗灰分不易受辐照剂量的影响，而粗脂肪含量和维生素的破坏程度随辐照剂量增多而增加，VA和VB6的损失最大[20]。

贮存时间对维生素的保存也有影响。贮存8个月后，饲料中总存留率较高的有维生素B2、维生素B12、泛酸钙、和维生素E，达70%以上，最高的是维生素B2(86%)；总存留率较低的有维生素A、维生素D3、叶酸、维生素B1，在45%～60%之间变化，最低的是维生素K(15%)[19]。已有标准中均未推荐配合饲料的贮存时间，实验鸡设施管理者需要根据自身时间情况考虑贮存过程对饲料营养物质特别是维生素的损失。

4 环境设施

“GB14925-2010实验动物环境及设施”是目前SPF鸡环境设施方面的标准技术文件，涉及SPF鸡的生产和实验的屏障环境、实验的隔离环境，但个别指标值得商榷，例如将鸡的生产间和实验间温度设为16℃～28℃，事实上因为禽类基础体温高于哺乳动物，2周龄以内的雏鸡饲养温度往往高于28℃。可以借鉴的是，北京市标准“DB11/T 402-2006 蛋鸡生产技术规范”中规定14日龄以内鸡舍温度要求36℃～32℃，安徽省农业科学院畜牧兽医研究所起草的“DB34/T 1650-2012海兰褐壳蛋鸡商品代饲养管理技术规程”也规定14日龄以内舍内温度37℃～29℃。另外，光照周期也应随鸡的日龄而有所变化。

5 饲养管理指南

由于SPF鸡与养禽业的饲养目标上不同，二者在饲养管理工艺上存在根本差异：SPF鸡的生产以避免病原体污染为第一要务，而普通蛋鸡的饲养环境与自然环境直接相通；SPF鸡和鸡胚内特定抗体必须阴性，原则上禁止接种任何疫苗或使用抗生素，而商品蛋禽必须接受一系列国家强制免疫的疫苗。例如，农业部标准“NY/T 5043-2001无公害食品蛋鸡饲养管理准则”规定“鸡舍内空气中灰尘控制在4 mg/m3以下，微生物数量应控制在25万/m3以下。雏鸡、育成鸡前期为预防和治疗疾病使用的药物，应符合NY 5040的要求。育成鸡后期(产蛋前)停止用药，停药时间取决于所用药物，但应保证产蛋开始时药物残留量符合要求”。而“GB 14925-2010实验动物环境及设施”规定SPF鸡生产间的空气洁净度最大为7级，即≥5 μm的尘粒数在293个/m3～2930个/m3之间；沉降菌最大平均浓度不大于3个CFU/0.5 h·φ90 mm平皿，并且SPF鸡原则上任何饲养阶段都禁止使用抗生素。

2017年中国实验动物学会发布实施的团体标准“T/CALAS 38-2017 实验动物 SPF鸡和SPF鸭饲养管理指南”规定了SPF鸡场的基本条件、环境与设施、引种、运输、饲养及生产管理、废弃物及尸体处理、问题处置的要求。将设施按功能区分为辅助区和生产区，推荐生产区应设有孵化室、储蛋库、更衣室和隔离检疫室，处于屏障环境。推荐使用后的隔离器应采用加热硅油和多聚甲醛蒸汽消毒；应用细砂纸或40℃的0.1%新洁尔灭溶液擦拭去除蛋表面的污物；育雏早期环境温度应随日龄而调整；建议采用本交方式交配，减少人工受精环节造成的污染；在4周龄时进行遗传学质量监测；20～22周龄时留种禽；病原学质量监测按照GB/T 17999.1-2008进行；在7～10日龄时断喙(上喙1/2处，下喙1/3处)，刚断喙后可增加饲料厚度，直至伤口愈合；饲喂过程要尽量轻柔安静，避免突然噪声；随时观察产蛋母鸡背部受伤情况，及时用药水处理，防止其它鸡群起啄之；废弃物应作无害化处理并达到 GB 8978-1996 污水综合排放标准的要求；发生意外死亡的尸体应及时清除，甄别死因后根据相关规定分别处理；污水处理符合GB 8978-2006 污水综合排放标准。

6 运输

与SPF鸡运输相关的标准有2018年1月29日实施的黑龙江省标准“DB23/T 2057.8-2017实验动物运输隔离器通用技术要求”。该标准适用于运输小、中、大型清洁级、无特定病原体级、无菌(含悉生)级实验动物的隔离器。“隔离器”被定义为一种整体密封、微环境控制、无菌传递，与外界环境完全隔离、保持一定压力和洁净度的实验动物饲养设备。“运输隔离器”是特指用于在不同地点、不同环境、不同设施或隔离器之间运输，或借助车辆运输(非航空)实验动物的隔离器。运输隔离器的结构包括主体、操作系统、通风、过滤系统以及支撑和移动结构。标准中列出多项技术整体要求，推荐隔离器内部动物活动空间符合动物的健康和福利要求，体重小于2 kg的鸡，笼内最小高度为0.4 m，每只鸡所占的底面积0.02 m2～0.12 m2；体重大于2 kg的鸡，笼内最小高度为0.6 m，每只鸡的底板面积为0.15 m2[21]。

7 展望

SPF鸡是生物医学、畜牧兽医等领域中从事科研、生物制品生产、检验重要的条件支撑之一。我国是SPF鸡的生产和使用大国，行业发展很快，国内自主培育的种质资源和市场份额非常少。但SPF鸡的总体水平依然在良性发展，涵盖多角度、不同层次的诸多SPF鸡质量控制标准的出台即是一个显著例证。在国家强调科技创新和标准化建设的有利背景下，已经有越来越多的社会团体和政府部门在积极推动和促进实验动物专业的标准化建设，相信业界同行会更加取长补短、互通有无、精诚合作，共同致力于我国禽类实验动物的质量提升，为行政许可和禽病生物制品行业的发展提供更加优质的条件支撑。

除本文提到的标准，与SPF鸡的质量相关的还有很多引用文件，尤其是饲料和鸡病诊断方面的国家标准和行业标准，也都适用于控制SPF鸡的质量，在此不再赘述。