实验动物病原PCR检测方法系列团体标准的编制

王 静，袁 文，闵凡贵，吴瑞可，潘金春，罗银珠，李 舸，郭鹏举，张 钰，黄 韧

(广东省实验动物监测所，广东省实验动物重点实验室，广州 510663)

实验动物是生命科学研究创新和生物医药产业发展不可或缺的支撑保障条件，被誉为“活的试剂和度量衡”，其质量直接关系着研究和评价数据的准确性。实验动物质量检测方法是实验动物质量管理的重要手段，标准的制定和更新是促进我国实验动物质量提升的主要方法。近年来，实验动物新的疾病病原不断出现，新的检测技术不断更新，仅靠国家标准的制定和更新已不能满足我国实验动物的质量管理的需求。本项目围绕实验动物病原检测技术，利用团体标准搞创新的优势，结合实际需求，制定了一批实验动物团体标准。这些团体标准是国家标准的有力补充，对促进行业内实验动物质量提升具有重要作用。

1 编制背景

我国实验动物的管理是行政许可管理方式。国家颁布了一系列实验动物管理法规和实验动物质量国家标准，各级实验动物管理机构按照标准要求进行实验动物质量监管，从而保障了我国实验动物的标准化应用。质量检测是实验动物质量监管的主要手段，标准的研究制定和发布实施是实验动物质量监管的技术措施。因此，需要对标准不断完善和提升，保持标准的的适用性、科学性、先进性。2018年1月1日新修订的《中华人民共和国标准化法》开始施行，在原有的国家标准、行业标准、地方标准、企业标准外，增加了团体标准，赋予团体标准法律地位。我国标准化体系，要最终形成“强制性标准守底线、推荐性标准保基本、行业标准补遗漏、企业标准强质量、团体标准搞创新”的格局。近年来，实验动物新的疾病病原不断出现，新的检测技术不断更新，利用团体标准搞创新的优势，开展实验动物质量检测方法研究，在行业内推广实施团体标准，是解决目前实验动物管理中国家标准更新滞后的较好方法[1-2]。

当前，在实验动物检测方法国家标准中，以针对抗体检测的血清学检测方法为主。但是抗体检测有一定局限性，不能应用于非血清样本的检测，如对免疫缺陷动物、动物接种物、生物制品、病死动物或环境样本的检测。以PCR技术为基础的病原学检测方法，针对特定病原体核酸序列中的保守片段设计特异性引物，检测某一种特定的病毒、细菌或寄生虫，具有特异性强、敏感度高、诊断快速等优点，可应用于实验动物疾病感染的早期诊断，无血清样本的检测，较好地弥补了传统抗体检测方法的不足，还可应用于新发传染病病原检测，难培养的病原的检测等，是实验动物病原监测的有力手段。美国和欧盟许多实验动物质量检测实验室都将PCR技术应用于实验动物病原监测，与抗体检测方法并行对设施微生物污染进行控制[3]。在国内增加实验动物病原PCR检测方法标准，制定成一系列团体标准，对加强实验动物质量和动物实验环境设施污染的质量控制具有重要意义。对提升和完善我国实验动物质量标准体系具有重要作用[3]。

2 标准范围

本系列团体标准包括螺杆菌、小鼠细小病毒MPV株、MVM株、汉坦病毒、肺支原体、大鼠泰勒病毒、大鼠细小病毒RMV株和RPV株等17种病原PCR检测方法(表1)。检测项目对照国家标准已设立的病原项目有12个(表1中1～12)，其中病毒11个，细菌1个。并增设了5个目前国标中没有要求的病原项目(表1中13～17)。

3 内容编制

各项团体标准基本结构主要有以下内容组成：范围；规范性引用文件；术语、定义及缩略语；检测方法原理；主要设备和材料；试剂；检测方法、结果判定、检测过程中防污染措施、附录等。

3.1 范围

规定了表1中所列各项病原PCR检测方法。适用于实验动物非血清样本病原核酸检测。

3.2 术语、定义及缩略语

介绍了标准中所涉及的几种PCR检测方法的定义，包括聚合酶链式反应(PCR)、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、巢式PCR、实时荧光PCR、实时荧光RT-PCR的定义。

3.3 检测方法原理

用合适的方法提取样本中的总RNA或/和DNA，分别针对病毒或细菌保守基因设计特异的引物探针序列，通过PCR对模板进行扩增，根据PCR检测结果判定该样品中是否含有某种病原特异核酸。

实时荧光PCR方法是在常规PCR的基础上，加入了一条特异性的荧光探针，探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′→3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，淬灭作用消失，荧光信号产生并被检测仪器接收，随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈对应关系。因此，可以通过检测荧光信号对核酸模板进行检测。

表1 已发布实施的实验动物PCR检测方法团体标准

3.4 设备和仪器

PCR仪、荧光PCR仪、生物安全柜等常规分子生物学实验室仪器设备。

3.5 试剂

RNA/DNA抽提试剂、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit；One Step PrimerscriptTMRT-PCR Kit(Perfect Realtime)或其他等效产品。引物和探针及其他辅助试剂

引物和探针：针对实验动物常见病原微生物核酸保守序列设计特异引物，进行PCR或反转录PCR扩增；根据表2和表3的序列合成引物和探针，引物和探针加无灭菌去离子水配制成10 μmol/L储备液，-20℃保存。

3.6 检测方法

3.6.1 样本采集和处理

标准中方法适用于动物组织样本、盲肠内容物或粪便、细胞培养样本、实验动物环境样本、饲料、垫料及饮水中病原核酸检测。根据不同样本处理要求，无菌采集样本进行核酸提取，采样过程中防止核酸降解及样本交叉污染。

3.6.2 RT-PCR检测

当目标病原核酸为RNA时，按RNA提取步骤进行核酸提取，再将提取的核酸反转录为cDNA后进行PCR反应。或者采用一步法RT-PCR试剂进行检测。反应液的配制在冰上操作，每次反应同时设计阳性对照、阴性对照和空白对照。按标准中推荐反应体系和参数进行PCR反应，或用其他等效的PCR检测试剂盒进行检测，反应体系和反应参数可做相应调整。反应结束，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测和拍照。

表2 普通PCR检测引物

3.6.3 普通PCR反应

当目标病原核酸为DNA时，按DNA提取步骤进行核酸提取，提取到的DNA作模板进行PCR检测。按标准中推荐反应体系和参数进行PCR反应，或用其他等效的PCR检测试剂盒进行检测，反应体系和反应参数可做相应调整。反应结束，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测和拍照

3.6.4 巢式PCR或巢式RT-PCR

当待检样本中可能含有的目标模板DNA/RNA含量极低时，使用巢式PCR或巢式RT-PCR提高检测敏感性。 使用巢式PCR引物进行2轮PCR，第二轮PCR反应时以第一轮PCR产物为模板进行，反应完成后取10 μL扩增产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。

3.6.5 实时荧光PCR

采用实时荧光PCR检测方法，可实现闭管操作，敏感性及特异性均优于普通PCR，是病原检测的首选检测方法。根据检测目标核酸，选择进行RT-实时荧光PCR或者实时荧光PCR检测。反应液的配制在冰上操作，每次反应同时设计阳性对照、阴性对照和空白对照。按标准中推荐反应体系和参数进行实时荧光PCR反应，或用其他等效的实时荧光PCR检测试剂盒进行检测，反应体系和反应参数可做相应调整。反应结束，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。

3.7 结果判定

3.7.1 普通PCR/普通RT-PCR

在阴性、阳性对照成立的条件下，即阳性对照的扩增产物经电泳检测可见到目的扩增条带(目的片段条带大小参见表1)，阴性对照的扩增产物无任何条带，可进行结果判定。样本孔观察到特定大小的目的扩增条带，判为该病原核酸阳性，否则为阴性。

3.7.2 实时荧光PCR/实时荧光RT-PCR

反应结束，对扩增曲线基线和阈值根据仪器的噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样本扩增曲线的最高点为准。质控标准为空白对照应无Ct值，无荧光扩增曲线，阴性对照无Ct值，并且无荧光扩增曲线。阳性对照Ct值应≤35，并且有明显的荧光扩增曲线，则表明反应体系运行正常，否则此次试验无效，需重新进行实时荧光PCR扩增。质控成立条件下进行结果判定。

若待检测样本无荧光扩增曲线，则判定该病毒核酸阴性；待检测样本有荧光扩增曲线，且Ct值应≤35时，则判断该病毒核酸阳性；若待检测样本Ct值介于35和40之间时，应重新进行实时荧光PCR检测。重新检测后，若Ct值≥40时，则判定该病毒核酸阴性。重新检测后的Ct值仍介于35和40之间，则判定该病毒核酸可疑阳性，需进一步进行序列测定。

表3 实时荧光PCR扩增引物和探针

注：未注明出处的为自行设计。

Note. Those without reference are self-designed.

3.7.3 序列测定

必要时，可取待检样本扩增出的阳性PCR产物进行核酸序列测定，序列结果与已公开发表的特异性片段序列进行比对，序列同源性在90%以上，可确诊待检样本某种病原核酸阳性，否则判定某种病原核酸阴性。

4 编制说明

4.1 本系列团体标准的适用性说明

PCR检测方法属于病原学检测方法，针对样本中的病原核酸进行检测，适用于非血清样本的病原检测，如免疫缺陷动物的健康监测、病死动物疾病诊断、实验动物接种物、实验动物环境样本检测等，是传统血清学检测方法的补充和完善。需要指出的是，当采用血清学和病原学检测方法对同一只动物进行检测时，可能出现不一致的结果，这是由于病原感染动物后抗原和抗体不同消长规律、检测对象不同造成。

4.2 本系列团体标准验证情况说明

17个团体标准已通过人工感染参考毒株的组织样品进行了方法可行性确认。完成了17项团体标准检测方法的3家单位验证。此外，利用9个参考毒株制备的样本，组织了全国范围内的实验室间比对，通过全国7个检测单位建立的核酸检测体系进行检测方法效果评价，除了一个单位的1个病原检测结果不一致，其它单位的检测结果完全一致。其中，部分检测单位使用的PCR检测方法与团体标准规定的方法一致。

4.3 本系列标准在临床应用的情况说明

本系列标准发布实施以来，已逐步被实验动物业内认识和接受，并被部分单位采纳作为实验动物病原的检测技术手段。如螺杆菌由于培养条件要求较高，较难通过培养进行鉴定，通过PCR方法采集动物盲肠内容物，就可以准确检测出阳性样本，耗时短，简单、易行，已成为临床螺杆菌检测的首选方法。国外研究报导，螺杆菌的感染率高达16.08%，病毒性病原中小鼠诺如病毒(MNV)、小鼠细小病毒MPV株(MPV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、小鼠细小病毒MVM株(MVM)、小鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)的感染率较高，依次为为32.37%、1.86%、1.59%、0.33%、0.26%[15]，我国实验动物质量检测数据统计显示，MNV、TMEV、MHV、MVM、螺杆菌具有较高的感染率，依次为16.2%～42.2%[16-18]， 5.29%～15.1%[18-19]、8.5%～19.9%[18-19]、12.0%[18]和45.3%[19]。这些病原一旦污染实施，往往难以清除。本标准实施以来，本单位应用团体标准中MHV PCR检测方法对广东某生产单位转基因动物环境样本进行检测，实现了该设施中MHV病原的逐步净化。通过灵敏的病原PCR检测方法，对环境设施污染的监控是维护实验动物设施生物安全的有利措施之一。

5 标准实施意义和展望

《实验动物 小鼠螺杆菌PCR检测方法》等系列团体标准的发布，为我国实验动物新发疾病的监控提供了标准技术方法，对提升实验动物质量具有重要意义，也对我们从国外引进动物的新发病原监控提供了技术手段。制定的实验动物高发病原新检测方法团体标准，从病原角度控制动物质量，再结合我国实验动物质量检测国标中的抗体检测方法，对彻底清除实验动物高发病原提供了规范的检测技术手段，完善了我国实验动物质量检测标准。实验动物质量检测技术方法团体标准的制定，将有效解决国家标准制定和更新滞后而严重影响实验动物质量问题，团体标准的创新模式，完善行业自律，对加速我国实验动物质量国家标准的制定和更新也具有重要作用。

对于实验动物行业来说，团体标准的编制与实施，突破了标准地域限制，应大力加强行业中推广应用，使其经得起实践和验证，为转化国家标准打好基础。