溶剂系统极性在高速逆流色谱分离油橄榄叶多酚类化合物过程中的影响

王 玉，全凯军，段文达，黄新异，郭 玫，邸多隆*

1中国科学院兰州化学物理研究所 中国科学院西北特色植物资源化学重点实验室 甘肃天然药物重点实验室；2甘肃中医药大学药学院，兰州 730000

高速逆流色谱(High-speed counter-current chromatography,HSCCC)自20世纪80年代初由美国科学家Ito博士研究开发以来，已经被广泛用于天然产物分离纯化领域，成为了一种新型而又高效的分离纯化技术。与传统柱色谱、制备液相色谱相比，HSCCC具有分离效率高、过程简单、样品不易被吸附等优势[1]。在整个HSCCC分离过程中溶剂系统的筛选和优化是至关重要的，在构建HSCCC分离方法的过程中，溶剂系统的筛选和优化占整个分离过程的40%～90%[2]。目前，溶剂系统选择的方法主要是通过查阅大量相关文献并参照已知溶剂系统，根据要分离化合物的基本理化性质寻找同类型化合物的分离实例。以此为依据，结合被分离的目标化合物调整实例中溶剂体系的极性并进行HSCCC分离。另外，还可以通过测定分配系数对溶剂系统进行筛选，如高效液相色谱法(HPLC)法测定溶质在上、下两相中的分配情况。具体方法是将样品溶解在等体积的所选溶剂系统的上下相混合体系中，然后通过HPLC测定其在其中一相(固定相)峰面积(A1)；接着测定样品在另一相(流动相)中的峰面积(A2)，最后通过分配系数计算公式：K=A1/A2，算得K值。这也是筛选溶剂系统最常用的一种方法。因此，发展高效的HSCCC溶剂系统筛选与优化方法，是提高HSCCC分离效率的关键因素之一，也是近年来该技术领域研究热点之一。目前，HSCCC溶剂系统通常由不同种类的非极性溶剂和极性溶剂组成的两相或三相溶剂体系，在HSCCC分离中，最常用的溶剂系统是Ito建立的一套溶剂体系，该溶剂体系由正己烷-乙酸乙酯-甲醇-正丁醇-水按不同的体积比组成[3]。Oka等设计了由正己烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇和水组成的溶剂体系。该溶剂体系覆盖的极性范围较宽，从非极性的正己烷/甲醇/水(2∶1∶1，v/v/v)到极性的正丁醇-水(1∶1，v/v)，利用这一溶剂体系能够对多种样品实现分离[4]。Foucault等将非极性溶剂体系正己烷/乙腈(1∶1，v/v)和极性溶剂体系正丁醇/水(1∶1，v/v)结合起来，配制成了7种溶剂体系—HBAW体系，这其中既有二元的、三元的也有四元的溶剂系统。HBAW体系对那些能够很好地溶解于正丁醇和乙腈(乙腈也可以用甲醇代替)中的样品非常适用[5],刘言娟[6]研究的的液-液/固三相溶剂系统被用于分离天然产物分离。

油橄榄叶是木犀科木犀榄属(Olea)常绿乔木植物油橄榄(OleaeuropaeaL.)的干燥叶，其主要化学成分是多酚、黄酮、有机酸、挥发油等化合物。研究表明油橄榄叶具有保护心肌、抗氧化、抗炎、抗癌以及神经保护等药理作用，其中橄榄苦苷和木犀草素-7′-O-β-D-葡萄糖苷(如图1)多酚类化合物是其主要有效成分[7-9]。

本文以油橄榄叶中的2种主要有效成分-橄榄苦苷和木犀草素-7′-O-β-D-葡萄糖苷为目标化合物(化学结构见图1)，通过系统考察正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水系统不同比例组成的两相溶剂系统对目标化合物分离的影响，探讨目标化合物极性和溶剂系统极性在HSCCC分离过程中的相关性，旨在为HSCCC溶剂系统快速筛选、提高HSCCC在复杂体系中分离制备目标化合物的效率提供技术支持。

图1 两种目标化合物的化学结构Fig.1 The chemical structures of two target compounds注：A代表橄榄苦苷；B 代表木犀草素-7′-O-β-D-葡萄糖苷Note∶ A indicated Oleuropein;B indicated Luteolin-7-O-β-D-glucoside

1 实验方法

1.1 仪器、试剂与材料

TBE-300B型高速逆流色谱仪(上海同田生物技术股份有限公司，中国)，包括TBD-2000 UV检测器和TBP-1002型恒压恒流泵(上海同田生物技术股份有限公司，中国)。Agilent 1200液相色谱仪(Agilent Technologies，美国)，包括：G1312A 恒流泵，G1315B 检测器，G1328B 手动进样器和 Agilent Chemstation software工作站；Sinochrom ODS-BP液相色谱柱(250 mm ×4.6 mm,5 μm)；KQ-250DE型数控超声清洗机(昆山超声仪器有限公司，中国)；BT224S型万分之一电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司，中国)。

实验用正己烷、乙酸乙酯、甲醇(天津市富宇精细化工有限公司，中国；分析纯)，所用水为蒸馏水。乙腈为色谱纯(江苏汉邦科技有限公司，中国)；乙酸为色谱纯(利安隆博华医药化学有限公司，中国)。橄榄苦苷对照品(美国，Sigma 公司，纯度：98.9%，批号：BCBN4404N)、木犀草素-7′-O-β-D-葡萄糖苷对照品(中国，四川省维克奇生物科技有限公司，纯度：98.0%，批号：wkq16052202)。

油橄榄叶采于甘肃省陇南市，经鉴定为木犀榄属植物油橄榄OleaeuropaeaL.的叶，样本保存在西北特色植物资源化学重点实验室。

1.2 油橄榄叶提取物的制备

称取干燥的油橄榄叶250 g，加入9～10倍量的60%乙醇溶液，于75 ℃加热回流提取2 次，每次1 h，滤过，合并2 次滤液，滤液减压回收乙醇后，烘干，即得油橄榄叶提取物提取物，备用。

1.3 HSCCC分离

1.3.1 分配系数K的测定

溶剂系统的选择根据目标化合物在两相溶剂体系中的分配系数K值。具体过程如下：称取油橄榄叶提取物20 mg，置于10 mL试管中，加入平衡后的上、下相各2 mL振荡使其完全溶解、静置分层，取上、下相各0.5 mL减压干燥，待干燥后分别用0.5 mL甲醇溶解，经0.45 μL滤膜过滤并进行HPLC检测分析。上、下两相峰面积分别为A1、A2，K=A1/A2。

1.3.2 两相溶剂体系及样品溶液的制备

本实验所选择的溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水，分别按不同比例配制1 000 mL置于1 L分液漏斗中，充分振荡使其混合均匀并于室温静置24 h且分层。待两相溶剂分层后分别取出上、下两相(上、下两相分别为固定相和流动相)并于20 ℃超声脱气20 min，备用。

取油橄榄叶提取物样品500 mg加入流动相(下相)20 mL使其完全溶解，即得样品溶液。

1.3.3 HSCCC分离

将固定相(上相)以20 mL/min的流速泵入高速逆流色谱仪的聚四氟乙烯螺旋管中，待固定相(上相)充满螺旋管后，开启高速逆流色谱仪，调整转速为950 rpm，同时流动相(下相)以1.5 mL/min的流速泵入充满固定相后的螺旋管中，待末端有流动相流出时，即螺旋管中上下相已达到动态平衡。将1.3.2项下制备的样品溶液从进样阀中注入高速逆流色谱仪，开启检测器并设置检测波长为232 nm，根据色谱图收集各馏分。各馏分按1.3.4项下色谱条件进行HPLC检测分析并采用面积归一化法计算纯度。

1.3.4 HPLC条件

色谱条件参考文献[9]：色谱柱：Sinochrom ODS-AP液相色谱柱 (250 mm ×4.6 mm,5 μm)流动相：A为0.2%的乙酸水溶液，流动相B为乙腈。梯度洗脱：0～25 min 18%～31% (B)；25～35 min 31% (B)；35～45 min 31%～50% (B)；进样量：20 μL；流速：1.0 mL·min-1；温度：25 ℃；检测波长：232 nm。

2 结果和分析

2.1 两相溶剂对2种目标化合物分离过程影响的考察

2.1.1 分配系数K的测定

本研究根据两种目标化合物性质，参考文献[3]选择HEMW系统(正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水)，考察正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水系统9种不同比例组成的两相溶剂系统对目标化合物分离的影响。按照1.3.1项分配系数K的测定方法，测定2种化合物在9种溶剂系统中的K值，结果见表1。

表1 两种化合物在9种溶剂系统中的分配系数

2.1.2 不同溶剂系统对分离的影响考察

将2.1.1项经测定分配系数K后，从6种HEMW溶剂系统中选择K值在0.5～2之间的6种溶剂系统，继续在HSCCC上进行目标化合物分离结果的考察，结果见图2。按照1.3.4项下HPLC色谱条件对6种不同溶剂系统分离所得目标化合物进行分析。目标化合物橄榄苦苷(化合物1)和木犀草素-7′-O-β-D-葡萄糖苷(化合物2)的色谱图见图3、4。图2可知，随着溶剂系统K值的增大，橄榄苦苷和木犀草素-7′-O-β-D-葡萄糖苷2种化合物在其两相溶剂系统(1∶5∶1∶5，v/v)、(1∶6∶1∶6，v/v)、 (1∶9∶2∶8，v/v)、(1∶9∶3∶7，v/v)、(1∶9∶1∶9，v/v)、(1∶19∶1∶19，v/v)的亲水性和溶解性依次呈现先增强后减弱趋势，但因溶剂系统(1∶9∶2∶8，v/v)保留时间过短导致其分离度较差，而在溶剂系统(1∶9∶3∶7，v/v)中分配能力最佳且分离效果呈现最好。因此，随着溶剂系统极性的增强，分离效率呈现先增强后减弱的趋势。

由图2可知：本实验溶剂系统采用6种HEMW溶剂系统[(1∶19∶1∶19，v/v)、(1∶9∶1∶9，v/v)、(1∶9∶2∶8，v/v)、(1∶9∶3∶7，v/v)、(1∶6∶1∶6，v/v)、(1∶5∶1∶5，v/v)]，按照1.3.2项下所述方法对油橄榄叶提取物进行HSCCC分离并根据HSCCC图谱(如图2)进行分段接样。将收集所得各组分于60 ℃减压旋蒸干燥并对其进行HPLC检测分析(如图3、4)。

图2 6种不同溶剂系统分离橄榄苦苷、木犀草素-7′-O-β-D-葡萄糖苷的HSCCC图Fig.2 HSCCC chromatograms of Olive leaves in 6 solvent systems注1-橄榄苦苷，2-木犀草素-7′-O-β-D-葡萄糖苷。Note:1-Oleuropein;2-Luteolin-7′-O-β-D-glucoside.

图3 化合物1在不同溶剂系统分离后的HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of compound1 in 6 solvent systems

2.2 溶剂系统极性和目标化合物极性对分离结果的影响

2.2.1 溶剂系统和目标化合物的极性

图4 化合物2在不同溶剂系统分离后的HPLC色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of compound 2 in 6 solvent systems

表2 9种溶剂系统的极性

2.2.2 溶剂系统和目标化合物的极性对K值的影响

以表1、表2中的溶剂系统极性变化和和对应K值做图，见图5。

图5 溶剂系统的极性(Polarity)与分配系数(K)之间的关系Fig.5 The relationship between polarity of the solvent system and partition coefficient K values

由图5的可以看出：随着溶剂系统极性的增加，化合物1和化合物2的K值呈现增加的趋势。这是由于K值是化合物在两相溶剂系统中的分配系数，由于化合物1和2的LogP值分别为-2.23和-4.58，表明两个化合物的亲水性较强。根据相似相溶原理，化合物在于其亲水性相近的溶剂中溶解性最好。溶剂系统极性的增加使溶剂系统中上相和下相的极性同时增大，化合物1和2在上相和下相的溶解性同时增大，但是在上相中增大的速率大于下相中增大的速率，因此K值随着溶剂系统极性的增加逐渐变大。溶剂系统极性的增加促进了化合物在上相中的分布，有利于化合物的分离。同时从图5中还可以看出：随着溶剂系统极性的增加，化合物2K值增加的趋势大于化合物1K值增加的趋势，表明亲水性越强的化合物(LogP值越小)，溶剂系统极性变化对其K值的影响越明显，因此溶剂系统同样的极性变化，亲水性强的化合物在上相中分布增加的更多，在一定极性范围内，化合物亲水性越强，K值随着溶剂系统极性增大而增加的趋势越大。

2.2.3 最佳溶剂系统的筛选

在HSCCC过程中最具挑战的工作是溶剂体系的筛选过程，而选择一个最佳的溶剂体系主要是通过测定样品在该溶剂体系中的分配系数K值来确定，合适的K值应该接近1并且理想的K值应该介于0.5～2之间[11]。当K>2.5时，出峰时间过长，峰形变宽；当K<0.5时，出峰时间太快，组分之间的分离度较差。由表1可知：通过测定目标化合物在9种不同比例中的分配系数K值，在正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(2∶8∶1∶9，v/v)、(2∶8∶2∶8，v/v)、(2∶8∶3∶7，v/v) 3种溶剂体系中化合物1、化合物2的K值均小于0.5，这三种溶剂体系会导致两化合物分离时间太短，分离效果差，作为HSCCC的溶剂体系不合适。因此，实验采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶剂比例分别为(1∶19∶1∶19，v/v)、(1∶9∶1∶9，v/v)、(1∶9∶2∶8，v/v)、(1∶9∶3∶7，v/v)、(1∶6∶1∶6，v/v)、(1∶5∶1∶5，v/v) 6种溶剂系统在HSCCC上进行两种化合物分离考察。通过K值适宜的6种溶剂系统对2种化合物在HSCCC上的实际分离。由图2可知，溶剂系统(1∶19∶1∶19，v/v)、(1∶9∶2∶8，v/v)、(1∶6∶1∶6，v/v)和(1∶5∶1∶5，v/v)分离效果不理想，溶剂系统(1∶9∶1∶9，v/v)虽然分离效果较好，但其出峰时间太晚。综合考虑，溶剂系统(1∶9∶3∶7，v/v;化合物1和化合物2的保留时间分别为35 min和47 min)为最佳的溶剂系统。

2.3 化合物的分离制备

以2.2.3项筛选的最佳溶剂系统[HEMW(1∶9∶3∶7,v/v)]，按照1.3.2项下制备溶剂体系及样品溶液，按照1.3.3项下HSCCC分离条件进行分离得到的化合物1(橄榄苦苷)和化合物2(木犀草素-7′-O-β-D-葡萄糖苷)。所得化合物1和化合物2按照1.3.4 项下HPLC法进行分析，并用橄榄苦苷和木犀草素-7′-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液进行标定和归一化法纯度检测，结果含量分别为87.8%和77.5%。

3 结论

本文以油橄榄叶中的2种主要有效成分-橄榄苦苷和木犀草素-7′-O-β-D-葡萄糖苷为目标化合物，通过考察溶剂系统和目标化合物极性对分离的影响，表明对于极性化合物而言，随着溶剂系统极性的增加，极性化合物的K值呈现增加的趋势。化合物极性越小，K值增加的趋势越大。在筛选溶剂系统时，在满足适宜的K值前提下，分离效率(目标化合物的保留时间)也是需要考虑的重要因素之一。本文通过结合K值和分离效率，优选出从油橄榄叶中分离制备其中主要的有效成分橄榄苦苷和木犀草素-7′-O-β-D-葡萄糖苷最佳溶剂系统[正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水,1∶9∶3∶7,v/v)。在优化的HSCCC色谱条件下，分离制备所得橄榄苦苷和木犀草素-7′-O-β-D-葡萄糖苷含量分别为87.8%和77.5%。本研究结果为HSCCC溶剂系统快速筛选、提高HSCCC在复杂体系中分离制备目标化合物的效率提供技术支持。