结肠癌组织血管生成抑制素结合蛋白、迁移诱导蛋白-7、MMP-2表达及其与血管生成拟态的相关性

李明玉，贾喜花

(保定市第一中心医院，河北保定071000)

结肠癌是近年发病率逐渐升高的消化道恶性肿瘤。目前结肠癌已成为我国重点防治的肿瘤之一。因此深入研究结肠癌发生发展的分子机制对改善患者总生存期具有重要意义。有研究[1]显示,肿瘤转移是影响结肠癌患者治疗效果和不良预后的关键因素之一。而新生血管形成是肿瘤生长及转移过程中不可或缺的因素[2]。内皮性血管及血管生成拟态(vasculogenic mimicry，VM)是肿瘤血供的两种重要形式。血管生成抑制素结合蛋白(AMOT)可调控内皮细胞的迁移和管状结构形成，在内皮性血管生成中起重要作用。VM是一种以肿瘤细胞为内衬的管状结构，具有血液灌注功能，区别于内皮细胞依赖性血管，在乏氧的肿瘤组织中是血液供应的主要方式[3]。迁移诱导蛋白-7(MIG-7)是VM形成过程中的重要调节因子，可增加肿瘤细胞的可塑性变化[4]。而基质金属蛋白酶-2(MMP-2)在内皮性血管[5]及VM形成[6]中均有参与。目前关于结肠癌组织AMOT、MIG-7、MMP-2的表达变化相关报道较少。2018年3～9月，我们观察了结肠癌组织AMOT、MIG-7及MMP-2的表达变化，并分析其与VM的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择保定市第一中心医院2015年1月～12月间收治的结肠癌患者，其中男37例，女33例；中位年龄58岁(28～88岁)，其中<50岁者17例，≥50岁者53例；分化程度为高分化35例，中分化21例，低分化14例；肿瘤直径<5 cm者 26例，≥5 cm者44例；浸润深度T1、T2者34例，T3、T4者36例；有淋巴结转移者22例，无淋巴结转移者48例。入选患者临床病理资料完整，病理明确诊断为腺癌。所有患者未合并其他恶性肿瘤，术前未进行抗肿瘤治疗(全身化疗及靶向治疗)。70例患者均行结肠癌根治术，术中保留结肠癌组织及癌旁正常组织。本研究经本院伦理委员会批准同意,纳入者或其家属均签署知情同意书。

1.2 试剂 AMOT鼠抗人多克隆抗体(产品编号60156-1-Ig)购自武汉三鹰生物科技公司、兔抗人多克隆抗体MIG-7(产品编号AY-66655R)购自上海安研生物科技公司；兔抗人多克隆MMP-2(产品编号bs-4599R)、兔抗人多克隆抗体CD34(产品编号bs-0646R)、鼠/兔通用型二抗(产品编号sp-0022)、DAB试剂盒及PAS染色试剂盒均购自北京博奥森生物科技公司。

1.3 癌组织及癌旁组织AMOT、MIG-7及MMP-2检测 采用免疫组化法。按照En Vision二步法的步骤进行实验：将石蜡标本以4 μm厚连续切片，烤干，于二甲苯溶液及不同浓度的乙醇中脱蜡至水洗，高压热修复抗原，3%H2O2去除内源性过氧化物酶，加一抗 AMOT(1∶100)、MIG-7(1∶100),、MMP-2(1∶100),抗体4 ℃过夜，PBS水洗后加二抗，37 ℃孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，脱水透明，中性树胶封固。用PBS代替一抗作为阴性对照。镜下AMOT阳性物质定位于胞核及胞质，MIG-7及MMP-2定位于胞膜及胞质，染色出现棕黄色为阳性表达。选择5个高倍视野(400×)进行观察，计数阳性细胞数及着色深度，无阳性细胞或阳性细胞数<10%计0分，阳性细胞10%～40%计1分，阳性细胞41%～70%计2分，阳性细胞>70%计3分；细胞不着色计0分,淡黄色计1分，黄色计2分，棕黄色计算3分。用染色强度得分和细胞数得分乘积作为判断标准，≤1判为阴性，>1判为阳性。最终免疫组化结果由两位经验丰富的病理科医师采用独立双盲法判定。

1.4 癌组织VM测算 采用CD34与PAS双重染色法。取癌组织石蜡标本，进行CD34免疫组化染色，DAB染色后蒸馏水冲洗使反应终止。按照说明书步骤行PAS染色。CD34定位于胞膜及胞质，染色后胞质出现棕黄色为阳性表达；选择5个高倍视野(400×)进行观察，计数CD34阳性细胞数占所观察细胞总数百分比及着色强度综合计算，阳性细胞数占所观察细胞总数百分比：无阳性细胞或阳性细胞<10%计0分，阳性细胞10%～40%计1分，阳性细胞41%～70%计2分，阳性细胞>70%计3分；着色强度：细胞不着色计0分,淡黄色计1分，黄色计2分，棕黄色计算3分。二者相乘结果≤1判定为CD34阴性，>1判定为CD34阳性。PAS染色后镜下观察基质呈红色可判为PAS阳性。显微镜下观察CD34与PAS双重染色结果，为CD34阴性、PAS阳性判定为VM阳性，计算VM阳性率(VM阳性例数/总例数×100%)。

1.5 随访方法 通过复查、电话联系等方式进行随访，随访时间(月)自手术之日起至2018年11月30日，随访终点为死亡、失访或生存至截止日期，随访期间的失访者算作删失值。

1.6 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件进行处理。计数资料比较用χ2检验；相关性分析应用Spearman相关性分析法，生存分析采用 Kapla-Meier 法，并应用Cox比例风险模型分析独立预后因素。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

癌组织 AMOT、 MIG-7、MMP-2阳性率分别为58.6%(41/70)、61.4%(43/70)、70%(49/70)，癌旁组织分别为31.4%(22/70)、0、4.3%(3/70)，与癌旁组织比较，癌组织 AMOT、 MIG-7、MMP-2阳性率均较高(P均<0.05)。结肠癌组织VM阳性率为32.9%(23/70)。AMOT、MIG-7、MMP-2表达及VM量与结肠癌患者临床病理参数的关系见表1。

AMOT表达与结肠癌患者分化程度及淋巴结转移有关(P均<0.05)，而与性别、年龄、肿瘤直径、浸润深度无关(P均>0.05)；MIG-7、MMP-2的表达水平及VM阳性量与分化程度、浸润深度及淋巴结转移有关(P均<0.05)。

表1 AMOT、MIG-7、MMP-2表达及VM阳性量与结肠癌患者临床病理参数的关系(例)

结肠癌组织AMOT表达与VM阳性量无相关性(P>0.05)，而MIG-7、MMP-2表达与VM阳性量均呈正相关(r分别为0.304，0.259；P均<0.05)。

Kaplan Meier 分析结果显示，分化程度、浸润深度、淋巴结转移、MIG-7表达水平与结肠癌患者的预后有关，而Cox回归模型分析显示年龄、分化程度、淋巴结转移、MIG-7蛋白水平及VM阳性是结肠癌预后的独立危险因素，见表2。

表2 结肠癌患者预后的多因素生存分析结果

3 讨论

AMOT于2001 年首次被发现，Troyanovsky等[7]通过以血管生成抑制素为诱饵的酵母双杂交系统在人类胎盘cDNA文库中筛选得到。Aase等[9]研究发现,敲除了斑马鱼AMOT基因后，于斑马鱼胚胎组织中早期观察到血管内皮生成障碍的现象，而在补充了AMOT后，血管内皮生成障碍现象得到逆转；并且在AMOT敲除后，内皮细胞对VEGF诱导的迁移无应答，证明了AMOT在生理性血管形成及VEGF诱导的内皮细胞迁移过程中的重要位置。此外，在关于AMOT与结肠癌的研究[10]中发现，AMOT可以通过Hippo-YAP通路上调ERK和AKT的磷酸化水平，而p-ERK和p-AKT涉及多种与肿瘤增殖、侵袭和转移相关的信通路。

AMOT在部分肿瘤组织中高表达,可促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。Byun等[11]研究发现，鼻腔和副鼻窦的内翻性乳头状瘤组织AMOT高表达。Hsu等[12]发现，AMOT 在肺癌组织和高侵袭性肺癌细胞中呈低表达。以上研究均提示AMOT在不同类型的癌细胞中的作用不同。本研究显示AMOT在结肠癌中高表达。AMOT还与结肠癌分化程度、浸润深度及淋巴结转移有关，提示AMOT的阳性表达与结肠癌的恶性程度和疾病进展密切相关。未发现AMOT与VM之间存在相关性。以上结果均表明该蛋白与VM的形成并无显著关联。此外,Kaplan Meier生存分析及Cox回归模型均显示AMOT与结肠癌预后无关，但本研究存在样本例数少、实验条件有限等不足，尚需后续研究进一步证实。

近年来国内外学者[13]先后在细胞、动物、人体层面证实了结肠癌组织中VM的存在。VM对肿瘤的影响主要集中在以下两个方面：①促进肿瘤的生长。传统抗血管生成药物对VM不起抑制作用，反而可能因为肿瘤组织的缺氧促进了VM的形成。在内皮性血管生成受抑的情况下，VM可继续为肿瘤组织提供营养，致使肿瘤组织进一步生长[14]；②增加远处转移机率。相比于内皮依赖性血管，肿瘤细胞自身构成VM的管腔壁，可以直接脱落进入血液循环，发生转移[15]。可见VM形成会促进癌细胞生长,增加肿瘤血道转移的几率。

MIG-7及MMP-2是VM形成的重要调节因子。本研究结果显示，MIG-7及MMP-2的表达与VM存在正相关。MIG-7能引起ERK1/2磷酸化水平升高，p-ERK1/2可作用于PI3K，进而增加其下游的MMP-2裂解层黏连蛋白5(LN-5v2)的能力。LN-5v2的裂解片段沉积于细胞外基质，参与基质重塑，促进VM 结构形成[15]。同时MIG-7可增加肿瘤细胞的可塑性，使其可以模拟内皮功能，参与构成VM的管腔壁[16]。MMP-2是基质金属蛋白酶家族(MMPs)的重要成员之一，参与VM形成的主干信号通路—EphA2/PI3K/AKT/MMPs[6]。进一步猜测其具体机制可能为MMP-2裂解LN-5v2，促进细胞外基质重塑。

MIG-7及MMP-2在多种恶性肿瘤[17，18]中均存在过表达现象，且过表达的MMP-2与肿瘤的浸润转移相关。本研究显示，结肠癌中MIG-7及MMP-2的阳性率高于癌旁组织，表明二者可能与结肠癌的发生、发展相关。在与结肠癌临床病理特征的研究中发现，MIG-7、MMP-2及VM的阳性率与分化程度、浸润深度及淋巴结转移有关，表明三者的阳性率与结肠癌的恶性程度相关，同时还与结肠癌的转移过程关系密切。Kaplan Meier生存分析显示，分化程度、浸润深度、淋巴结转移、MIG-7蛋白水平与结肠癌患者预后相关，而Cox回归模型分析显示年龄、分化程度、淋巴结转移、MIG-7蛋白水平及VM阳性是结肠癌预后的独立危险因素。由此可见MIG-7对于判断结肠癌患者的预后具有重要参考价值，可作为评估结肠癌患者预后的潜在分子标志物。

综上所述，结肠癌组织中AMOT、MIG-7、MMP-2均呈高表达。MIG-7、MMP-2可能通过调控结肠癌VM的形成，影响结肠癌的侵袭、转移及预后。MIG-7、MMP-2可作为评估肠癌患者预后的潜在分子标志物。