口腔鳞癌组织CD133、血管内皮生长因子C的表达变化及其意义

李月洁，周铁军，刘艳，李雪，龚莉

(西南医科大学附属医院，四川泸州646000)

OSCC是口腔肿瘤中最常见的组织学类型，约占口腔肿瘤的90%[1]。由于口腔颌面部淋巴管较丰富，约半数OSCC患者首诊时已出现淋巴道转移[2]，预后较差，5年生存率约60%。肿瘤干细胞(CSCs)是肿瘤细胞中一部分具有自我更新能力、多向分化潜能、高致瘤性和耐药性的细胞，是肿瘤复发和转移的重要原因[3, 4]。CD133是一个具有五个跨膜结构域的糖蛋白，最早在小鼠神经干细胞及人造血干细胞中发现，但它不仅表达于正常干细胞，也表达于肿瘤的CSCs[5]，是认可度较高的肿瘤干细胞标记物。血管内皮生长因子C(VEGF-C)是血管内皮生长因子家族中的一员，可促进血管生成，还可通过促进淋巴管内皮细胞的增殖和转移促进淋巴管生成和淋巴结转移[2, 6, 7]。有报道[8, 9]称，CSCs可通过促进VEGF-C的分泌促进淋巴管生成和淋巴结转移。OSCC组织中VEGF-C与淋巴管生成的相关报道较少。我们观察了OSCC组织CD133、VEGF-C的表达变化，分析其临床意义。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集西南医科大学附属医院病理科2010年1月～2013年12月间收治的163例OSCC患者(观察组)，其中男110例、女53例；年龄24～79岁，中位年龄58岁，≥60岁者72例，<60岁91例；病变部位为舌52例、颊49例、腭4例、唇6例、牙龈19例、口底33例；肿瘤直径<4 cm者122例、≥4 cm者41例；病理分级为高分化77例，中分化52例，低分化34例；TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期78例，Ⅲ～Ⅳ期85例；有淋巴结转移72例，无淋巴结转移91例。观察组均行肿瘤切除术，术中保留癌组织石蜡标本，术前均未接受任何放化疗。另收集正常口腔黏膜石蜡组织37例为对照组。两组年龄、性别比例等一般资料具有可比性。本研究经本院伦理委员会批准同意。

1.2 试剂与方法 鼠抗人单克隆抗体CD133购自武汉三鹰公司(66666-1-ig)，稀释比例1∶500，EDTA修复；兔抗人多克隆抗体VEGF-C购自Bioworld公司(BS7382)，稀释比例1∶200，柠檬酸修复；鼠抗人单克隆抗体D2-40购自北京中杉金桥公司(ZM-0465)，稀释比例1∶100。Envision两步法试剂盒(中杉金桥公司)，浓缩型DAB试剂盒(中杉金桥公司)。采用Envision二步法，切片常规脱蜡脱水，高压热修复，其余严格按说明书执行。

1.3 两组OSCC组织CD133、VEGF-C检测 采用免疫组化法。结果均由病理科两名高年资主治医师，单独进行评测。CD133及VEGF-C的阳性表达主要位于细胞质，呈淡黄色至棕黄色颗粒。CD133阳性细胞≤10%计1分，10%<阳性细胞≤33%计2分，34%<阳性细胞≤66%计3分，阳性细胞>67%计4分；染色强度为无着色计0，淡黄色计1分，棕黄色及2分，棕褐色计3分。两相相乘结果0～3判为(-)，4～6判为(+)，7～9判为(++)；≥10判为(+++)[10]。VEGF-C阳性细胞≤5%计0分，6%<阳性细胞≤25%计1分，26%<阳性细胞≤50%计2分，51%<阳性细胞≤75%计3分，阳性细胞>76%计4分。染色强度计分与CD133一致。上述两种评分的乘积0～1为-、2～3为+、4～7为++；≥8为+++[11](染色强度需与背景相对比)。-判为阴性，+、++、+++判为阳性。计算两组CD133、VEGF-C阳性表达率。阳性表达率=阴性例数/总例数×100%。

1.4 两组OSCC组织淋巴管密度(LVD)测算 测算两组LVD，LVD定位于OSCC组织淋巴管内皮细胞，先在低倍镜下观察淋巴管数量最多的区域，即热点区。在热点区用200倍视野进行观察，随机选取6个视野，分别计数淋巴管数量，求其平均值[12]。

2 结果

观察组、对照组CD133阳性表达率分别为66.26%、10.81%(P<0.05)。观察组、对照组VEGF-C阳性表达率分别为79.14%、21.62%(P<0.05)。观察组、对照组LVD分别为7.66±3.54、3.53±1.05(P<0.05)。

CD133、VEGF-C表达与OSCC患者临床病理学参数的关系见表1。CD133表达与OSCC患的临床分期、分化程度、淋巴结转移有关(P均<0.05)。年龄<60、≥60岁OSCC患者LVD分别为7.57±3.37、7.77±3.77，男、女OSCC患者LVD分别为7.43±3.52、7.88±3.47，病变部位为舌、颊、腭、唇、牙龈、口底OSCC患者LVD分别为8.12±4.02、8.26±3.38、7.24±5.21、6.33±2.56、7.22±3.12、6.58±3.00，临床分期为ⅠⅡ期、Ⅲ及Ⅳ期OSCC患者LVD分别为5.68±2.25、9.47±3.55，高、中、低分化OSCC患者LVD分别为7.32±3.53、8.32±3.72、7.41±3.26，肿瘤直径<4 cm、≥4 cmOSCC患者LVD分别为7.51±3.44、7.50±3.58，有、无淋巴结转移OSCC患者LVD分别为10.21±3.18、5.64±2.18。LVD与OSCC患者临床分期及淋巴结转移有关(P均<0.05)。

OSCC组织中CD133、VEGF-C的表达呈正相关(rs=0.46，P<0.05)。

OSCC患者中CD133阴性、阳性者的LVD分别为5.60±1.56、8.71±3.80(P<0.05)。OSCC患者中VEGF-C阴性、阳性者LVD分别为6.41±1.51、7.99±3.84(P<0.05)。

3 讨论

口腔黏膜被覆复层鳞状上皮，在生理状况下细胞更新和受伤修复时，由位于上皮基底部的干细胞通过不对称分裂产生的子代细胞定向分化进行再生修复，使口腔黏膜保持完整性。CSCs具有自我更新、多向分化能力，在肿瘤的侵袭、转移、复发、耐药等过程中发挥重要作用，是恶性肿瘤浸润、转移和复发的源泉。淋巴道转移是大多上皮源性恶性肿瘤的主要转移途径，也是口腔鳞癌预后不良的重要原因。因此，诱导淋巴管生成是实体肿瘤发生淋巴结转移非常重要的条件，然而目前CSCs与淋巴管生成的关系还不甚清楚。

CD133蛋白是造血干细胞比较特异的标记物。

表1 CD133、VEGF-C表达及LVD与OSCC患者临床病理参数的关系

高表达CD133的肿瘤细胞具有自我更新及多向分化等干细胞特性，因而 CD133被认为是实体肿瘤中比较好的肿瘤干细胞标记物[13, 14]。本研究发现，观察组、对照组CD133阳性表达率分别为66.26%、10.81%，差异有统计学意义，与Ravindran等[15]研究结果相近。进一步分析CD133的表达与口腔鳞癌患者临床病理参数的关系发现，其与口腔鳞癌的临床分期、分化程度、淋巴结转移有关。提示OSCC组织中存在CD133+的干细胞样细胞，且该细胞在口腔鳞癌的发生、发展、转移过程中起着重要作用。

研究[16]发现，肿瘤干细胞可以通过刺激血管内皮生长因子(VEGFs)的分泌，促进肿瘤血管的形成。而VEGF-C是血管内皮生长因子家族成员之一，其受体包括VEGFR-2和VEGFR-3。其中VEGFR-2 在淋巴管及血管内皮细胞均有表达，而VEGFR -3 则主要在淋巴管内皮细胞表达。VEGF-C可通过与其受体VEGFR-3结合，使其发生自身磷酸化，再通过细胞质内信号传递，增加淋巴管内皮细胞有丝分裂活动，诱导淋巴管的生成[17]。本实验结果显示口腔鳞癌组织及正常口腔黏膜中VEGF-C阳性表达率分别为79.14%、21.62%，差异具有统计学意义，且其表达与口腔鳞癌的临床分期及淋巴结转移有关。进一步分析VEGF-C与淋巴管密度的相关性发现，口腔鳞癌VEGF-C+组淋巴管密度显著高于VEGF-C-组，提示VEGF-C可能参与了口腔鳞癌淋巴管生成的过程，促进淋巴结转移[18]。

在对人类胶质细胞瘤的研究中，CD133+的干细胞样胶质瘤细胞能持续分泌VEGF，比CD133-的干细胞样胶质瘤细胞释放更多的VEGF，并且在经过缺氧诱导后发现，CD133+的干细胞样胶质瘤细胞分泌的VEGF会进一步提高，提示CD133+的胶质瘤干细胞能够调控VEGF的分泌，从而调动内皮祖细胞，促进局部血管生成[4]。而人类乳腺癌的研究中发现CD44+/CD24-/low的干细胞样细胞亚群中VEGF-C的水平更高[8]，提示肿瘤干细胞可能通过调控VEGF-C的分泌，调控淋巴管内皮细胞的增殖与迁移，促进淋巴管的生成和淋巴结转移。例如在对淋巴水肿的动物模型的研究中发现，经VEGF-C诱导培养后的脂肪干细胞，可以向淋巴组织分化，形成新生淋巴管[19]，同样在肾细胞癌、乳腺癌、卵巢癌的研究中也发现，在加入VEGF-C的诱导培养条件下，肿瘤干细胞可以发生转分化，产生具有内皮细胞表型及功能特征的子代细胞[9]，提示在高表达VEGF-C的肿瘤微环境中，肿瘤干细胞可能发生转分化，并逐步形成新生淋巴管，进而促进淋巴结转移的发生。本实验研究发现在口腔鳞癌组织中CD133及VEGF-C的表达具有正相关关系，在高表达CD133的口腔鳞癌组织中VEGF-C呈高表达水平，提示在口腔鳞癌肿瘤微环境中CD133+干细胞样口腔鳞癌细胞亚群可能与VEGF-C相互影响，相互作用，最终发挥促进淋巴管生成及淋巴结转移的作用。 口腔鳞癌肿瘤微环境中CD133+的干细胞样口腔鳞癌细胞亚群可能是诱导肿瘤淋巴管生成，促进肿瘤发生淋巴结转移的重要病理过程中的始动因素，也可能是该过程中的关键一环。

综上所述，OSCC组织中CD133、VEGF-C呈高表达状态，CD133、VEGF-C可能与肿瘤淋巴管生成与淋巴结转移的发生发展有关。