SNAP法在乳产品安全检测中的应用

买合木提·克衣木，余世田，许辉

（1.新疆巴州动物疾病控制与诊断中心，库尔勒 841000；2.西南大学动物科技学院，重庆 400715）

SNAP法（又称双流向酶联免疫技术）是经过美国分析化学家协会（AOAC）认证的抗生素检测方法，是国际食品法典委员会（CAC）中抗生素残留的标准检测方法，并获得美国食品药品监督管理局（FDA）认可[1]，也是目前我国抗生素残留检测使用的常规方法之一。该方法是一种免疫学的ELISA法，测定原理是将特定抗原类群作为靶子，使样品中的抗原和内置抗原标记物共同与固定包被抗体发生竞争反应，通过酶与底物的显色反应，测定吸光值，判定结果阳性还是阴性。该法简化了检测过程，具有灵敏度高，操作简单等特点[2]，为畜牧生产企业提供了一种快速、简单和可靠的从源头控制食品质量安全的检测方法。

1 SNAP法在检测奶制品抗生素残留中的应用

抗生素一般是指致病微生物，包括细菌、霉菌、支原体和衣原体等。根据2017年的数据分析，全世界用于食品动物的抗生素到2030年将达到105.596t[3]。目前，在奶牛乳房炎的防治中，抗生素依然是首选的常规药物。在婴幼儿奶粉中也有抗生素检出[4]，抗生素残留对婴幼儿的危害尤为严重，其主要危害表现为产生过敏反应、引起细菌耐药性、造成肠道环境紊乱和菌群失调[5]。牛乳中抗生素残留的来源主要有两个，一是用于治疗奶牛疾病而使用的内服或者外用抗生素在奶牛体内经循环代谢到达乳房并未及时排出，或者未按照抗生素使用规范规定的用量和停药期等进行操作；二是不按照卫生规范和操作规范给奶牛挤奶并向鲜乳中添加防腐用抗生素[6，7]。

丁洁等[8]通过SNAP法和国标TTC法(嗜热链球菌抑制法)对牛奶中三种不同浓度的β内酰胺药物分别检测。结果表明，SNAP法能够在美国FDA安全浓度范围内检测出极微量的β内酰胺抗生素（2.0ng/mL 氨苄西林、1.0ng/mL青霉素钾和1.0ng/mL头孢匹林，FDA规定的安全浓度分别为氨苄西林10.0ng/mL、青霉素钾5.0ng/mL、头孢匹林2.0ng/mL），而国标TTC法在FDA规定的安全浓度以内，阳性检出率均为0。同时细菌干扰和冻融对SNAP法的检测稳定性和可靠性研究表明，在含有安全浓度的三种β内酰胺药物的奶样中，添加3×106cfu/mL金黄色葡萄球菌和大肠杆菌对SNAP法检测结果没有影响，同时冻融处理对SNAP法检测结果也没有影响。王文辉等[9]的研究也表现出同样的结果，但是SNAP法对氨基糖苷类抗生素并没有表现出更高的灵敏度；对大环内酯类、四环素类和磺胺类的检测，在其最大残留限量范围内不能阳性检出，且其灵敏度低于TTC法；对氟喹诺酮类抗生素和氯霉素的检测无效。

2014年，樊蕴秀[10]采用SNAP法和杯碟法对生乳进行了β-内酰胺的检测，结果显示表明杯碟法能在较小的浓度（5U/mL）下检测出β-内酰胺残留，而SNAP法在较小浓度（5U/mL）下可能表现出假阳性，需要杯碟法进行进一步的确认。Kneebone 等[11]也采用了SNAP法检测了美国雀巢、荷兰ELK和法国Regilait三家企业的五种奶制品，结果显示，在欧盟和美国FDA规定的最大残留限度内对β内酰胺抗生素拥有较好的检测效果，并未出现假阳性和假阴性情况。Rama等[12]也得出相同结果，同时液相色谱法在残留允许范围内能阳性检出阿莫西林、青霉素G和邻氯青霉素。

SNAP法在检测山羊原料奶时，假阳性率仅有1%，同时乳品质对检测结果几乎没有影响[13]。SNAP法能在三聚氰胺浓度达到0.285ppm时检测出所有阳性，最低检测限度可以达到0.1ppm[14]。

通过数据库检索关键词检索，对有效检索文献中的数据汇总得表1。从结果可以看出，SNAP法与国标TTC法对比，在检测β-内酰胺类抗生素时，表现出极高的灵敏度，且灵敏度高于TTC法。但对于β-内酰胺类以外的抗生素，该方法并没有表现出更高的灵敏度甚至完全无效。同时，SNAP法在比较低的浓度下也极易表现出假阳性，需要用杯碟法或液相色谱法等其他方法进一步辅助检测。

2 SNAP法在检测黄曲霉素中的应用

霉变饲料中含有大量的黄曲霉素B1，B1是黄曲霉素中毒性最强、致癌性最强的一种。动物摄取黄曲霉素B1后，在肝脏细胞微粒体细胞色素P-450作用下，黄曲霉素B1会转化为黄曲霉素M1，代谢进入乳中[19]。人食用后，极有可能引起肝癌，而且对婴幼儿的危害可能更为严重[20]。付成平等[21]用SNAP法和高效液相色谱法对35个批次的生鲜奶、纯牛奶进行了黄曲霉素M1的测定。SNAP法检测结果中有7个样品为阳性，对阳性样品进行高效液相色谱定量分析，结果显示黄曲霉素M1含量在0.116～0.302μg/L范围，而SNAP法的检测灵敏度为0.5μg/L。这说明，在检测黄曲霉素残留中，SNAP法存在报告假阳性的情况。

表1 SNAP法在检测抗生素残留中的应用

在检测黄曲霉素的方法中，薄层液相色谱是一种传统的经典方法[22]，同时酶联免疫法是目前国际上采用的一种测定黄曲霉素的高效而科学的方法，目前主要利用酶联免疫法检测出可疑样品，再用薄层色谱法进行确认，效果可以达到国际先进水平（灵敏度可达到0.1μg/L，变异系数为0.4%～2.6%）[23]。酶联免疫法在检测黄曲霉素的应用中还表现出重复率低，且某些样品还需要预处理，所以该方法一般用于初筛[24]。目前黄曲霉素的国家标准检测方法主要包括胶体金法、薄层分析法、酶联免疫法、高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等[25]，以酶联免疫为基本原理的SNAP法在检测黄曲霉毒素中的应用还鲜有报道。

3 SNAP法的优缺点及建议

3.1 SNAP法的优点与不足

SNAP法在检测抗生素残留中有其优点也有其不足，主要表现在检测时间、广谱性和检测成本上。

从检测的时间来看，SNAP法属于快速检测法，反应时间不到10min[26]，反应结果是当颜色越深或光度越强时表示阴性，反之表示阳性[27]。与国标TTC法、杯蝶法、薄层色谱法等相比，在检测时间上具有明显的优势。

从广谱性来看，SNAP法只能保证对β-内酰胺类抗生素具有较好的效果，能在低于MRL的浓度下就能检测出β-内酰胺类抗生素残留，并且其稳定性也较好；但是对除β内酰胺类以外的抗生素并没有表现出更好的检测效果，甚至完全无效。同时，SNAP法只能进行定性检测，无法检测出准确的抗生素含量。SNAP法对黄曲霉素的检测灵敏度同样不高，易出现假阳性报告。

从检测成本上来看，SNAP法检测成本相对较高，需要购买专用仪器和试剂，但其仪器稳定性良好，结果重现性好，并且仪器可随身携带，便捷性远高于其他方法。

3.2 建议

（1）在检测β-内酰胺类抗生素时，SNAP法具有极大的优势，在只需要定性检测的情况下，完全可以替代其他方法。但若需要定量检测时，SNAP法只可以作为筛选方法，然后对筛选出的阳性结果再进行定量检测。但检测结果也易出现假阳性，需用其他方法进行验证。

（2）除此之外，该法对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类和磺胺类等灵敏度较低，所以不建议单独使用该法作为检测该类抗生素的方法。同时该方法不能使用于对氟喹诺酮类抗生素和氯霉素的检测。

（3）该法在检测黄曲霉素时的灵敏度较低，在检测黄曲霉素时，应当与薄层色谱法相结合，将SNAP法作为初筛的方法，用薄层色谱法加以验证。