利用荧光定量技术检测生鲜乳中黄曲霉毒素M1

郑君杰，方芳，孙志伟，贾涛，李征，何月新

（北京市饲料监察所，北京 100107）

黄曲霉毒素（aflatoxin，AF）是多种霉菌（如黄曲霉和寄生曲霉）产生的有毒代谢物，是人类癌症的一个重要致癌原。至今已分离出的黄曲霉毒素及其衍生物有20多种，自然界中主要包含四种亚型（黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2）。动物进食发霉饲料后，黄曲霉毒素一部分蓄积在动物体内，另一部分则会转化到乳汁和尿液中，转化率一般为3.45%～11.39%，排出AFM1的量为AFB1摄入量的1%～3%[1]。黄曲霉毒素B1可通过羟基化转化为黄曲霉毒素M1，因此牛奶中就会含有黄曲霉毒素M1，目前各毒素亚型已知毒性大小顺序为AFB1＞AFM1＞AFG1＞AFB2＞AFG2[2]。黄曲霉毒素M1相对稳定，常规处理方法如巴氏杀菌不会对其产生影响，因此如果生鲜乳中存在黄曲霉毒素M1，其终端产品中也将存在，所以很多国家对乳及乳制品中黄曲霉毒素M1含量进行了限制。

本试验使用荧光定量检测卡及高通量实时荧光定量检测仪测定生鲜乳中黄曲霉毒素M1含量，检测原理是以荧光素作为发光物质来标记抗体，检测样本中相应的目标物。荧光定量检测技术检测速度快、操作简单、成本低廉，已经在临床诊断、环境监测等领域得到广泛应用[3]。通过计算机辅助半抗原合理设计，采用杂交瘤、荧光标记等技术，获得了荧光定量快速检测卡，检测卡中的硝酸纤维素膜（NC）含有固定于测试区（T）的包被抗原、控制区（C）的多克隆抗体和固定于结合释放垫上的荧光素标记抗体。当将待测样品滴加在加样区时，样品中的目标物在毛细渗移过程中与荧光素标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和T区包被抗原的结合，使T区荧光减弱；反之，T区荧光增强。采用荧光读数仪读取T线荧光强度，借助仪器内置的标准曲线即可计算出样品中目标物含量。

1 材料和方法

1.1 材料

黄曲霉毒素M1荧光定量检测卡。

1.2 仪器

微量移液器；计时器；荧光免疫定量分析仪（北京维德维康生物技术有限公司，型号：FQ-S1）。

1.3 样品的制备

空白样品：生鲜乳。

添加样品：向空白样品加入黄曲霉毒素M1标准品至所需浓度。

表1 空白样品测定结果统计表 单位：μg/L

表2 准确度和精密度

1.4 试验方法

1.4.1 最低检测限测定

取20份空白样品，按照黄曲霉毒素M1荧光定量检测卡操作说明书方法进行检测，计算出其平均值，再加上3倍标准差，即为最低检测限。

1.4.2 准确度和精密度

准确度是指测定值与真实值的符合程度。取空白生鲜乳样品按0.05μg/L、0.1μg/L黄曲霉毒素M1标准品进行添加，每个添加5个平行，使用黄曲霉毒素M1荧光定量检测卡进行检测。

1.4.3 与仪器方法比较

采用黄曲霉毒素M1荧光定量检测卡和高效液相色谱法分别对50份生鲜乳盲样进行测定，比较测定结果，以检测限作为阴阳性判定值。

2 结果与分析

2.1 最低检测限测定

结果表明，计算出的最低检测限为0.047 μg/L（表1）。为保障产品的稳定性，将黄曲霉毒素M1荧光定量检测卡在生鲜乳中的检测限定为0.05μg/L。

2.2 准确度和精密度

用3个批次的检测卡测定，结果见表2。结果表明，所有样品各添加浓度的回收率均在90.00%～110.00%之间。各添加浓度的批内、批间变异系数均低于15%。

2.3 与仪器方法比较

表3 与仪器方法比较结果 单位：μg/L

用该黄曲霉毒素M1荧光定量检测卡和《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素M族的测定》（GB5009.24-2016）第二法[4]分别对50份生鲜乳盲样进行测定，比较测定结果，以检测限作为阴阳性判定值。小于黄曲霉毒素M1荧光定量检测卡检测限的检测结果记为“-”，仪器结果记为“ND”；大于黄曲霉毒素M1荧光定量检测卡检测限的以实际检测值表示（表3）。结果显示，二者的符合率为100%。

3 讨论

因为生鲜乳贮存条件特殊，不宜长时间运输贮存，所以快速检测方法对生鲜乳质量监测具有重要意义，尤其是现场检测，可以提高工作效率，加大监测范围和力度，保证生鲜乳及乳制品质量安全。目前实验室常用的快速检测方法主要有酶联免疫吸附法（ELISA法）和胶体金法。ELISA法可以定量但对实验室条件要求比较高，适合大批量样品同时检测；胶体金法快捷简便，但一般用于定性。这些方法均不能很好地满足在奶站和奶车现场快速检测、养殖场对个别奶牛连续监测等方面的要求。而本文所采用的荧光定量检测法具有以下几个优点：①试验所需仪器设备少，只需要一台配套荧光定量检测仪即可，不需要离心机等多个辅助设备；②操作时间短，高通量实时荧光定量检测仪在15min内即可完成检测；③少量、大批量样品筛查均适合，一次可以做1～10个样品，可根据样品量使用检测卡，节省检测成本，后续还可以进行数据实时上传；④检测卡可常温保存，没有酶标物、抗体、底物等材料，对保存条件要求低；⑤可以准确定量。

黄曲霉毒素M1荧光定量检测卡在生鲜乳中的检测限为0.05μg/L，农业部近两年在全国生鲜乳专项监测计划中，要求快速方法的检出限为不高于0.05μ g/kg。大多数国家都对食品或饲料中黄曲霉毒素含量进行了限制，如欧盟将牛奶和奶粉复原乳中黄曲霉毒素M1限量规定为0.05μ g/L或50ppt，婴幼儿配方奶粉和婴儿医用特殊食品中的限量值为0.025μg/kg；我国《食品安全国家标准 食品中真菌毒素安全限量》（GB2761-2017）中规定乳及乳制品中黄曲霉毒素M1限量值为0.5μg/kg；美国食品与药品监督管理局（FDA）和日本规定的牛奶中黄曲霉毒素M1限量值也为0.5μg/kg[5]。从以上数据可以看出，荧光定量检测卡在生鲜乳中黄曲霉素素M1快速筛查中，其检测限能够满足我们国家专项监测要求，同时低于或等于大多数国家安全限量值，也能够满足相关乳企质量安全检测要求。

2016年，武瑞霞等[6]就国内外乳及乳制品黄曲霉毒素M1污染问题进行了综述，认为乳及乳制品中黄曲霉毒素M1污染仍是一个全球尚未解决的问题，污染程度在地理分布上，总趋势是从内陆向沿海、自北向南增高。我国是个乳品消费大国，因此对生鲜乳中黄曲霉毒素M1的控制更应该加强。本研究使用荧光定量检测卡检测黄曲霉毒素M1，各添加浓度回收率均在90.00%～110.00%之间；各添加浓度批内、批间变异系数均低于15%；黄曲霉毒素M1荧光定量检测卡和仪器法盲样测定符合率为100%。通过添加、盲样测定、与仪器方法比较等试验，表明该方法简便快捷、检测结果准确可靠，可以用于生鲜乳检测机构及奶牛养殖场、奶站、奶车的现场黄曲霉毒素M1快速检测。