益肾健脾泻浊中药对妊娠加重慢性肾损伤大鼠的保护机制❋

刘文康，冯桃花，柴亚男，郝 娟，武 宁，许庆友,2，王 筝,2△，王香婷,2△

(1. 河北中医学院，石家庄 050091； 2. 河北省中西医结合肝肾病证研究重点实验室， 石家庄 050091)

慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)是全球主要的公共健康问题，严重危害人类的身体健康。女性作为CKD的高发人群(发病率12.9%)，其妊娠面临着重大挑战[1]。妊娠是加重慢性肾脏病损伤的独立危险因素[2]，不仅对母体产生损伤，还会影响新生儿质量，且相关的肾脏疾患都有不同程度的加重[3]。

在前期研究化瘀涤痰通络中药抑制细胞增殖的过程中，发现单侧输尿管梗阻可激活醛固酮(aldosterone，ALD)，介导炎性损伤、刺激肾脏固有细胞增殖、胶原沉积等多种病理反应，最终导致肾纤维化进展[4]。在此基础上，本研究以“肾脾亏虚，浊毒内蕴”为病机，以妊娠合并单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral occlusion，UUO)为动物模型，以醛固酮活化-SGK-1/NF-κB-细胞增殖-ECM积聚为途径，给予醛固酮受体阻断剂及益肾健脾泻浊中药治疗，初步探讨其抑制醛固酮活化、下调SGK-1/NF-κB表达、抑制细胞增殖、保护肾功能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雌性未经产Wistar大鼠90只，雄性Wistar 大鼠20只，8周龄，体质量(160±20)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号SCXK(京)2016-0006)。本实验设计和方案充分考虑安全和公平的原则，研究过程中涉及的实验动物均符合国家对医学实验动物的有关要求。

1.2 药物

螺内酯片(杭州民生药业有限公司，生产批号T18B040)。益肾健脾泻浊方组成：黄芪 20 g，当归 5 g，山药 15 g，山茱萸 15 g，土茯苓 20 g，泽泻 15 g，白芍 12 g，怀牛膝 12 g。神威药业免煎中药配方颗粒(生产批号17103061，17102361，17062111，17081151，17061251，17091411，17032651，17060421)，混匀煎煮15 min。

1.3 主要试剂与仪器

Cr试剂盒贝克、BUN试剂盒(曼库尔特公司，生产批号AUZ3562，AUZ3611)；ALd试剂盒、Progesterone试剂盒、Estradiol试剂盒(天津九鼎医学生物公司，生产批号RA21810，RG51805，RG61805)；PCNA(proteintech公司，生产批号00044915)； SGK-1、GAPDH(Affinity 公司，生产批号19U71，AB54162)；NF-kB p65 (servicebio公司生产批号181905)；免疫组化通用SP试剂盒(中杉金桥生物公司，生产批号K185910G)。γ-放射免疫计数器FJ-2021(西安二六二厂)；小型垂直电泳槽、半干转印槽(Bio-Rad公司)；显微照相仪、病理图文分析系统DP72CCD，BX53显微镜(Olympus公司)。

1.4 模型建立及分组

雌性未经产Wistar大鼠90只，适应性喂养1周，按随机数字表法分为假手术组(Sham)、假手术+妊娠组(SP)、UUO组(UUO)、UUO+妊娠组(UP)、UUO+妊娠+螺内酯组(SPI)、UUO+妊娠+中药组(TCM)，每组各15只。UUO组采用UUO手术复制慢性肾病肾间质纤维化模型，水合氯醛注射麻醉，切开腹部分离左侧输尿管，于上下1/3处结扎后剪断，缝合腹部。假手术组仅将输尿管游离但不结扎离断。UUO术后，SPI组大鼠给予螺内酯50 mg/kg/d灌胃[5]，TCM组大鼠给予益肾健脾泻浊中药3.11 g/kg/d 灌胃(结合文献记载[6-8]，本实验大鼠处于妊娠前后，用法用量应适度，药物的药力达到祛除大半病邪即可，故采用低剂量给药)，每天1次。UUO术后第9周，对SP组、UP组、SPI组、TCM组大鼠进行阴道涂片，观察动情周期。在动情前期及动情期，雌雄大鼠以1∶1比例进行合笼并密切观察，发现阴栓之日确定为妊娠第1天。妊娠雌鼠称体质量，单独饲养。妊娠第18天将大鼠放入代谢笼，留取24 h尿。次日处死母鼠，股动脉留取全血离心取血清，摘取健侧肾脏，部分置于4%多聚甲醛，部分肾组织-70 ℃保存。

1.5 指标检测及方法

1.5.1 肾脏组织形态学改变 肾脏组织经4%多聚甲醛固定，梯度脱水、包埋，切片厚度4 μm，行HE、Masson染色。

1.5.2 各组大鼠肾功能 血清肌酐(Scr) 和尿肌酐(Ucr)采用苦味酸法测定，尿素氮(BUN)采用尿素酶-谷氨酸脱氢酶法测定，按试剂盒说明书要求进行检测。计算内生肌酐清除率(creatinine clearance，Ccr)，内生肌酐清除率=尿肌酐×24 h尿量/血肌酐/1440。

1.5.3 各组大鼠血清醛固酮水平 放射免疫法测定血清醛固酮含量，采用液相平衡竞争放射免疫分析法。125I标记抗原(×Ag)与未标记抗原(Ag)竞争限量抗体(Ab)上的结合位点。制备样品，配置标准品，孔内分别加入样本、标记物、抗体，充分混匀37 ℃静置1.5 h，加入分离剂充分混匀，4 ℃ 3600/r离心20 min，弃上清测量沉淀物cpm。计算复管静计数的平均值进行数据处理。

1.5.4 各组大鼠妊产情况及血清孕酮、雌二醇含量 UUO术后第9周开始观察SP组、UP组、SPI组、TCM组大鼠动情周期，合笼后记录见阴栓情况。妊娠结束前处死母鼠，观察大鼠见栓怀孕率、产仔数、死胎数、流产胎数，留取大鼠股动脉血，检测血清孕酮(progesterone，P)、雌二醇(estradiol,E2)含量。

1.5.5 免疫组化检测肾脏组织SGK-1、NF-κB、PCNA蛋白表达 采用SABC法检测，切片，梯度脱水，抗原修复，加一抗SGK-1、NF-κB、PCNA(浓度均为1∶100)，4 ℃孵育过夜；加入二抗，PBS清洗，滴加SABC复合物，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，封片。以镜下出现棕黄色为阳性表达。

1.5.6 Western blot 检测肾脏SGK-1、NF-κB、PCNA的蛋白表达 将100 g肾脏组织剪碎匀浆、裂解组织蛋白、定量，20～60 μg蛋白上样，90 V电泳2 h半干转膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，加入兔抗鼠一抗SGK-1(1∶1000)、PCNA(1∶1000)、NF-κB(1∶500)，4 ℃孵育过夜，TBST清洗，羊抗兔二抗(均为1∶20000)，TBST清洗后显影成像。以GAPDH 作为内参校正，并利用Image J系统进行定量分析，比较目的条带/内参条带的灰度值。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠肾脏组织形态学改变

图1显示，HE、Masson染色结果显示,假手术组大鼠肾小管结构清楚，小管上皮细胞结构完整，排列整齐，间质无水肿，少量纤维成分表达。UUO造模各组大鼠肾小管扩张明显，小管间质及细胞外基质纤维化明显，大量炎性细胞浸润，UP组较UUO组损伤更为严重。SPI组和TCM组大鼠肾脏炎性细胞浸润及胶原沉积情况较UUO组明显减轻。

注：扩张的肾小管；炎性细胞；胶原纤维图1 大鼠肾脏组织HE、Masson病理改变(×400)

2.2 各组大鼠肾功能情况

表1显示，与假手术组比较UUO各组大鼠BUN、Scr明显升高，肌酐清除率明显降低(P<0.01)，UP组改变更明显；螺内酯及中药组大鼠尿素氮、血肌酐水平有所降低(P<0.05,P<0.01)，Ccr明显升高(P<0.01)。

表1 各组大鼠血肌酐、尿素氮、肌酐清除率

注：与sham组比较：**P<0.01；与SP组比较：▲▲P<0.01；与UUO组比较：■P<0.05，■■P<0.01； 与UP 组比较：▽▽P<0.01

2.3 各组大鼠血清醛固酮水平

表2显示，与假手术组比较，UUO各组大鼠血清醛固酮含量显著升高(P<0.01)；与SP 组比较，UUO组及UP组表达明显增高(P<0.01)；SPI组及TCM组大鼠血清醛固酮含量较UP组明显降低(P<0.01)。

表2 各组大鼠血清醛固酮、孕酮及雌二醇水平比较

注：与sham组比较：**P<0.01；与SP组比较：▲▲P<0.01；与UUO组比较：■P<0.05，■■P<0.01；与UP 组比较：▽P<0.05，▽▽P<0.01

2.4 各组大鼠妊产情况及血清孕酮、雌二醇含量

表3显示，观察发现SP组大鼠动情周期规律，见栓率高；UP组多数大鼠动情周期紊乱，部分甚至出现严重阴道炎症，见栓率低；SPI组、TCM组部分大鼠也出现周期紊乱的现象，见栓率也相对较低。SP组大鼠见栓怀孕率高、产仔数高、不完全流产情况很少出现，平均产仔数多；UP组见栓怀孕率低，不完全流产情况严重，平均产仔数明显减少；SPI组、TCM组见栓怀孕率较UP组高，大鼠产仔数较高，不完全流产情况相对减少，平均产仔数相对较多。

表3 各组大鼠妊产情况比较

注：1.见栓雌鼠是指雌雄合笼后见到阴栓的雌鼠数；2.见栓怀孕雌鼠指确定怀孕雌鼠数目，即=足月产雌鼠+不完全流产雌鼠；3.不完全流产情况是指雌鼠孕有多胎小鼠，少数仔鼠未能存活至分娩，在妊娠期间已胎停育，而大多数仔鼠能正常娩出；4.全组大鼠平均产仔数=全组所有大鼠所孕育成熟胎鼠数/见栓雌鼠；5.组内孕鼠平均产仔数=全组所有大鼠所孕育成熟胎鼠数/见栓怀孕雌鼠

表2显示，与S组、U组比较，SP组、UP组、SPI组、TCM组大鼠血清P、E2表达水平明显升高(P<0.05，P<0.01)；其中SP组表达水平最高，UP组表达相对较低，SPI组、TCM组P、E2水平高于UP组大鼠(P<0.05，P<0.01)。

2.5 免疫组化检测肾脏组织SGK-1、NF-κB、PCNA蛋白表达

图 2显示，假手术组大鼠肾脏SGK-1、NF-κB、PCNA呈弱表达，主要见于远端肾小管；UUO造模各组上述指标表达均明显增强，UP组表达高于UUO组。SPI组和TCM组表达范围及强度较UUO组均明显减弱。

注：SGK-1、NF-κB、PCNA 在肾小管上皮细胞的表达比较假手术组大鼠肾脏SGK-1、NF-κB、PCNA呈弱表达，主要见于远端肾小管；UUO造模各组上述指标表达均明显增强，UP组表达高于UUO组图2 免疫组化检测各组大鼠肾脏组织SGK-1、NF-κB、PCNA蛋白表达(×400)

2.6 Western blot 检测肾组织SGK-1、NF-κB、PCNA的蛋白表达

图3显示，与假手术组及SP组比较，UUO各组大鼠SGK-1、NF-κB、PCNA蛋白表达明显增强(P<0.05,P<0.01)，UP组PCNA的表达高于U组(P<0.05)，螺内酯及中药可下调其表达(P<0.05,P<0.01)。

注：与Sham组比较：#P<0.05，##P<0.01；与SP组比较：▲P<0.05，▲▲P<0.01；与UUO组比较：■P<0.05；与UP组比较:▽P<0.05，▽▽P<0.01图3 Western blot检测对照组及模型组大鼠肾脏SGK-1、NF-κB、PCNA蛋白表达比较

3 讨论

近年来，慢性肾脏病的发病率呈升高趋势，育龄妇女为0.1%～3%[9]。妊娠使CKD患者原有肾脏病变加重，肾小球硬化和玻璃样变，出现重度贫血和子痫的几率明显增加[10-11]。有研究表明，CKD患者在妊娠晚期出现妊娠期高血压病与肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活密切相关[12]，其下游效应分子醛固酮作用更为重要。在肾脏损伤和妊娠的双重作用下，RAAS系统失衡进而诱导醛固酮合成增多。活化的醛固酮可通过SGK-1/NF-κB 信号通路引起炎性损伤进而诱导细胞过度增殖[13]，增殖的细胞分泌 ECM 参与间质纤维化进展。前期研究证实，肾脏损伤可诱导醛固酮活化，通过SGK-1信号通路刺激肾小管上皮细胞增殖，参与肾纤维化进展。给予醛固酮受体阻断剂依普利酮可抑制醛固酮活性，下调SGK-1表达进而抑制细胞增殖[14]。本研究结果显示，UUO造模各组大鼠小管间质及细胞外基质纤维化明显，血清醛固酮含量显著升高，SGK-1、NF-κB、PCNA蛋白表达明显增强，UP组表达高于UUO组，说明妊娠诱导醛固酮活化，通过SGK-1/NF-κB 信号通路引起炎性损伤，加重慢性肾病大鼠细胞增殖及纤维化。

慢性肾病合并妊娠属于本虚标实之证，以肾脾亏虚为本，浊毒内蕴为标。慢性肾脏病，素体本虚，孕后血聚养胎，胎儿夺精伤母，脾肾亏虚更甚，脾虚

失于运化传输，肾虚不能气化开阖，三焦决渎失司，水湿内停，酿生浊毒。虚则补之，实则泻之，以益肾健脾泻浊为法。益肾健脾泻浊中药由黄芪、当归、山药、山茱萸、土茯苓、泽泻、白芍、怀牛膝组成。补益气血，扶助正气；健脾益肾，固涩敛阴；利水除湿，泻浊解毒。少佐怀牛膝，补益肝肾，活血通经，且补气而不瘀滞，活血而不伤正。诸药相伍，补中寓泻，标本兼顾。现代研究表明，当归的主要成分阿魏酸与黄芪组分黄芪甲苷可改善造血功能障碍，提高机体免疫力[15]。黄芪、当归配伍，可通过减少尿蛋白，降低系膜细胞的增殖分化，缓解肾小管间质的损伤，保护足细胞裂孔膜结构的完整性，进而减少继发性肾脏损害[16]；山药微粉可在一定程度上提高抗氧化能力[17]。白芍主要成分白芍总苷对减少炎症介质和炎性因子的分泌有一定作用，可有效保护肾脏功能[18]。

本研究结果表明，益肾健脾泻浊中药通过抑制醛固酮活化，下调SGK-1/NF-κB表达，进而抑制细胞增殖，减轻肾间质纤维化的机制，为临床预防治疗提供了理论依据。

致谢：本实验主要在河北省中西医结合肝肾病证研究重点实验室完成，在此对实验室的各位老师及同学的帮助致以衷心的感谢！)