淫羊藿黄酮类成分指纹图谱研究

牛晓静　鲁静　段晓颖　徐立然

摘要：目的 建立淫羊藿中黃酮类成分HPLC指纹图谱。方法 采用Agilent ZORBAX Eclispse SB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 ?m），以乙腈（A）-水（B）为流动相，梯度洗脱（0～8 min，15%→25%A；8～25 min，25%A；25～32 min，25%→33%A，32～48 min，33%→38%A；48～60 min，38%→60%A；60～70 min，60%→85%A；70～75 min，15%A），流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长为270 nm，进样量10 ?L。对11批淫羊藿指纹图谱进行相似度分析及方法学考察。结果 11批淫羊藿药材有21个共有峰，相似度为0.845～0.952，对5个色谱峰进行了归属；方法学考察结果表明，建立的分析方法重复性、精密度、稳定性良好；相似度分析将11批淫羊藿分为4大类，与淫羊藿物种鉴定结果一致。结论 不同产地淫羊藿有一定的相似性，HPLC指纹图谱能够为淫羊藿的物种鉴定及内在质量评价提供依据。

关键词：淫羊藿；黄酮类成分；指纹图谱；高效液相色谱法

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2019）03-0088-05

Abstract： Objective To establish HPLC fingerprints of flavonoids ingredients in Epimedii Folium. Methods The chromatographic fingerprint was obtained with Agilent ZORBAX Eclispse SB-C18 （4.6 mm × 150 mm， 5 ?m） as chromatographic column， with acetonitrile （A） - water （B） as the mobile phase for gradient elution （0–8 min， 15%→25% A； 8–25 min， 25% A； 25–32 min， 25%→33% A； 32–48 min， 33%→38% A； 48–60 min， 38%→60% A； 60–70 min， 60%→85% A； 70～75 min， 15% A）. The flow rate was 1.0 mL/min， and the column temperature was maintained at 30 ℃. The detection wavelength was set at 270 nm. The similarity analysis and methodological investigation were conducted to fingerprints of 11 batches of Epimedii Folium. Results There were 21 common peaks with similarities between 0.845 and 0.952 in 11 batches of Epimedii Folium and 5 chromatographic peaks were identified. The methodological investigation results showed that the established analytical method had good repeatability， precision and stability. Similarity analysis divided 11 batches of Epimedii Folium into 4 categories， consistent with the identification results of Epimedii Folium species. Conclusion Epimedii Folium from different producing areas have a certain of similarities. HPLC fingerprints can provide basis for species identification and intrinsic quality evaluation of Epimedii Folium.

Keywords： Epimedii Folium； flavonoids ingredient； fingerprints； HPLC

淫羊藿为小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.、箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxim.或朝鲜淫羊藿Epimedium koreanum Nakai的干燥叶，夏、秋季莲叶茂盛时采收，晒干或阴干[1]。产地多集中在中国东北、西北、华东、西南及山西、河南等[2]，由于不同品种在形态特征、生境特征、居群大小、繁殖方式、资源利用状况和地方土名等方面的差异，物种鉴定尚存在诸多疑问[3-4]。指纹图谱是基于对中药物质群整体作用的认识，借助波谱和色谱等技术获得中药化学成分的光谱或色谱图，是实现鉴别中药真实性、评价质量一致性和产品稳定性的可行模式，具有信息量大、特征性强、整体性和模糊性等特点，能对中药内在质量进行有效表征、综合评价和全面控制[5]。本课题组采用指纹图谱方法对淫羊藿黄酮类成分进行分析，并对5种黄酮类成分进行归属，为淫羊藿的物种归属和鉴定提供一定依据。

1 仪器与试药

Waters e2695型高效液相色谱仪（美国沃特世公司），Waters 2998型紫外检测器（美国沃特世公司），TU-1800PC型紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），CP225D型电子天平（德国赛多利斯集团），BSA224S-CW型电子天平（德国赛多利斯集团）。

11批淫羊藿編号为S1～S11，依次为箭叶淫羊藿（20140217-1，东北吉林）、淫羊藿（130716，甘肃陇南）、柔毛淫羊藿（20140303，四川）、箭叶淫羊藿（20140303-2，甘肃）、淫羊藿（130107，甘肃阳县）、箭叶淫羊藿（20140303-1，甘肃）、朝鲜淫羊藿（20140217-2，东北吉林）、淫羊藿（20140303，陕西）、箭叶淫羊藿（140301，甘肃陇南）、朝鲜淫羊藿（131107，辽宁辽阳）、朝鲜淫羊藿（131015，吉林通化），经本院陈天朝主任药师鉴定，符合2015年版《中华人民共和国药典》（一部）规定。淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ对照品（批号分别为110737-200415、111852- 201102），中国食品药品检定研究院；朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C（批号分别为130520、130518、130601），成都普菲德生物技术有限公司；甲醇、乙腈均为色谱纯，水为高纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Agilent ZORBAX Eclispse SB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 ?m），以乙腈（A）-水（B）为流动相，梯度洗脱（0～8 min，15%→25%A；8～25 min，25%A；25～32 min，25%→33%A；32～48 min，33%→38%A；48～60 min，38%→60%A；60～70 min，60%→85%A；70～75 min，15%A），流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长270 nm，进样量10 ?L。理论板数按淫羊藿苷峰计算应均不低于5000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ对照品，精密称定，加甲醇溶解稀释，制成混合对照品溶液，浓度分别为朝藿定A 48.84 ?g/mL、朝藿定B 95.2 ?g/mL、朝藿定C 0.1031 mg/mL、淫羊藿苷52.5 ?g/mL、宝藿苷Ⅰ6.475 ?g/mL。

2.2.2 供试品溶液的制备

取本品粉末（过3号筛）约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇20 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）1 h，再称定质量，用稀乙醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。进样前用0.45 ?m微孔滤膜过滤。

2.3 指纹图谱方法学考察

2.3.1 精密度试验

取淫羊藿样品（批号130716），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，连续测定6次，记录色谱图。以参照峰的保留时间和峰面积为参比，结果供试品溶液中各共有峰相对保留时间的RSD为0.04%～0.971%，相对峰面积的RSD为0.15%～2.97%，表明该方法精密度好。

2.3.2 重复性试验

取淫羊藿样品（批号130716），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析。结果供试品溶液中各共有峰相对保留时间的RSD为0.13%～1.48%，相对峰面积的RSD为0.56%～3.20%，表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验

取淫羊藿样品（批号130716），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于室温放置0、2、4、8、12、24 h，按“2.1”项下色谱条件进样分析。结果24 h内供试品溶液中各共有峰相对保留时间的RSD为0.19%～3.38%，相对峰面积的RSD为0.526%～2.65%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.4 专属性试验

精密吸取空白溶液10 ?L，注入色谱仪，按规定的梯度条件洗脱，结果表明阴性对照无干扰。

2.4 样品测定

取11批淫羊藿样品（见表1），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，结果见图1。

2.5 特征指纹图谱的建立

2.5.1 参照峰的选择

在各批样品指纹图谱中，淫羊藿苷的保留时间居中，分离度良好，且为淫羊藿的主要黄酮类成分之一，故确定13号峰淫羊藿苷为参照峰（S）。

2.5.2 特征指纹图谱的建立及相似度评价

将11批淫羊藿色谱图数据导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）》进行自动匹配，以淫羊藿共有模式图谱为标准，进行整体相似度评价，11批淫羊藿的相似度为0.845～0.952，同时确定了21个共有峰，根据对照品保留时间与紫外光谱图指认了其中10、11、12、13、20号峰分别为朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和宝藿苷Ⅰ，共有模式见图2，混合对照品HPLC图见图3。11批淫羊藿指纹图谱共有峰相对保留时间和相对峰面积见表1、表2，相似度评价结果见表3。

对各批淫羊藿指纹图谱进行直观分析可见，保留时间52 min之前的色谱峰有良好的相似度；保留时间在52～75 min之间的极性相对较小的成分各批次之间有较大差异，其中，S1～S9号各色谱图比较相似，与S10、S11号色谱图有较大差异。根据相似度评价可以看出，不同产地、批次的淫羊藿有一定的相似性，但也存在一定的差异，各共有峰峰面积差异较大，黄酮类成分含量有较大差异。S2、S5、S8相似度在0.990～0.995，S7、S10、S11相似度在0.990～0.995，S1、S4、S6、S9相似度在0.952～0.971。这3类相似度较高的样品分别为淫羊霍、朝鲜淫羊藿、箭叶淫羊藿，与淫羊藿物种鉴定结果一致，而S3与其他批次有差异，为柔毛淫羊藿。

3 讨论

指纹图谱在中药质量的综合评价和控制方面有很大的发展，在化学指纹图谱、生物指纹图谱和代谢指纹图谱等技术方面都有突破性的进展。除用于考察中药材的归属、鉴别[6-10]，以提供生产前原料药材真伪优劣的鉴别依据，更可用于中药生产过程的质量控制，追踪制剂中某些化学成分的变化，监测原料药材与成品之间、成品各批次间质量的一致性及稳定性[11-14]。

淫羊藿因物种来源不同，质量有差异，某些产地样品相似度不好，这给进一步对淫羊藿进行药效学研究带来极大不便。本研究建立了淫羊藿中黄酮类成分的指纹图谱方法，并对其中5个成分进行指认，方法简便快捷、精密度、重复性良好，结果表明能够客观反映各共有峰所代表的化学成分含量高低，11批样品相似度为0.845～0.952。不同产地、批次的淫羊藿有一定的相似性，但也存在一定的差异，指纹图谱能够为淫羊藿的物种鉴定及内在质量评价提供依据，更能反映出淫羊藿各有效成分含量的综合差异。

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（收稿日期：2018-02-27）

（修回日期：2018-05-23；编辑：陈静）