清解扶正颗粒体外抑制血管新生的作用机制研究*

2019-03-29 02:55曹治云余旋魏丽慧曾建伟赵锦燕黄彬林久茂
实用中西医结合临床 2019年1期
关键词:培养箱新生基质

曹治云 余旋 魏丽慧 曾建伟 赵锦燕 黄彬 林久茂#

(1福建中医药大学中西医结合研究院 福州350122;2福建省中西医结合老年性疾病重点实验室 福州350122)

肿瘤的发生发展与机体正气不足、脏腑功能失调及热毒积聚密切相关,多因气滞、血瘀、痰凝、毒聚而形成[1]。中医药在肿瘤的治疗中发挥着独特的作用,已经证实有些中药具有通过调控肿瘤血管生成从而达到抗肿瘤的功效。清解扶正颗粒(Qingjiefuzheng Granules,QFG)是临床验方,由白花蛇舌草、半枝莲、炙黄芪、炒麦芽等组成,其中白花蛇舌草为君,具有清热解毒、消痈散结、利尿除湿的功效;半枝莲为臣,具有清热解毒、活血祛瘀、消肿止痛的作用,辅助君药,增强清热解毒之功效;黄芪为佐,具有补气健脾、益卫固表、利尿消肿、生津的功效,调和君臣的寒凉之性;麦芽为使,具有行气消食、健脾开胃、退乳消胀的功效,在增强君臣作用之时,调和脾胃运化,兼顾后天之本。清解扶正颗粒临床辅助化疗药物治疗多种恶性消化道肿瘤,具有改善患者的生活质量、减轻胃肠不良反应等作用。我们的实验研究表明QFG对大肠细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用[2],但治疗大肠癌等恶性肿瘤的作用机制尚不清楚。故本研究在前期研究的基础上,探讨了QFG对血管新生的调控作用,以期为QFG的临床应用提供实验依据。现报道如下:

1 材料与方法

1.1 药物与细胞株 清解扶正颗粒(QFG)由福建中医药大学药学院制剂室提供,用磷酸盐缓冲液(PBS)配成200 mg/ml储存溶液,超声30 min助溶,用0.45 μm过滤器过滤,再用培养基配成所需要的浓度。人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)购自中科院上海细胞库。

1.2 试剂 RPMI 1640培养基、双抗(青霉素-链霉素)、胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)、0.25%胰蛋白酶、二甲亚砜(DMSO)均购自美国Gibco公司;四甲基偶氮唑蓝[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT]干粉购自北京索莱宝科技有限公司;PBS购自美国Hyclone公司;管腔形成试剂盒购于德国Merck Millipore公司,VEGF-A、VEGFR-2购于美国 Proteintech公司,MMP-2、MMP-9抗体购自中国BBI Life Sciences公司。

1.3 仪器 超净工作台(苏州净化设备公司);二氧化碳培养箱、-80℃超低温冰箱(美国Thermo公司);倒置显微镜系统(德国Leica仪器有限公司);形态学显微图像分析系统LAS V4.1、Countes全自动细胞计数仪(美国Life公司)。

1.4 细胞培养 将HUVEC分别培养于含10%FBS、1%双抗(含 100 U/ml青霉素和 100 μg/ml链霉素)的RPMI 1640完全培养基中,并于37℃、5%CO2和饱和湿度的细胞培养箱中培养,待细胞单层贴壁生长至汇合度为80%~90%时,加入1 ml的胰蛋白酶消化1~3 min,随后加入2 ml完全培养基终止消化,于离心机中以1 000 r/min的转速离心3 min后,吸弃上清并收集沉淀细胞用于后续实验。

1.5 MTT法检测细胞增殖 收集HUVEC细胞,加入完全培养基,分别制备密度为1.0×105个/ml的细胞悬液,并按100 μl/孔的原则均匀地接种于96孔培养板中,培养于细胞培养箱中,当每孔细胞的汇合度达到50%~60%时,轻轻吸走原孔中培养基,随后每孔分别加入100 μl不同浓度的QFG(终浓度分别为 0、0.125、0.25、0.5、0.75、1 mg/ml,其中 0 mg/ml为对照组),干预24 h或48 h后再次吸走原孔中溶液,并加入等体积的MTT溶液(100 μl/孔,0.5 mg/ml),继续培养4 h后吸弃各孔中的液体,每孔加入等体积DMSO并振荡混匀,于酶标仪570 nm波长处测定各孔吸光度值(A值),计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率(%)=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。

1.6 细胞形态观察 收集HUVEC细胞,加入完全培养基,分别制备密度为2.0×105个/ml的细胞悬液,并按2 ml/孔的原则接种于6孔板中,培养于细胞培养箱,待每孔细胞汇合度达到50%~60%时,吸弃孔中原培养基,并重新加入等体积不同浓度的QFG(终浓度分别为 0、0.125、0.25、0.5、0.75、1 mg/ml,其中0 mg/ml为对照组)干预24 h,并在倒置显微镜下观察细胞形态变化并拍照记录。

1.7 划痕实验 收集HUVEC细胞,加入完全培养基,分别制备密度为1.0×105个/ml的细胞悬液,并按2 ml/孔的原则接种于6孔板中,培养到铺满单层,用无菌枪头在单层细胞上划出一字痕,用PBS洗细胞3次,去除划下的细胞,加入含有QFG的培养液后放入37℃、5%CO2的培养箱培养24 h,于6 h、18 h、24 h不同时间点测量并拍照。

1.8 管腔形成实验 收集HUVEC细胞,加入完全培养基,分别制备密度为2.0×105个/ml的细胞悬液,并按2 ml/孔的原则接种于6孔板中,培养于细胞培养箱,待每孔细胞汇合度达到50%~60%时,吸弃孔中原培养基,并重新加入等体积不同浓度的QFG(分别为 0、0.25、0.5、0.75 mg/ml),干预 24 h后,将细胞收集并配制成2×105细胞悬液,以1∶1比例加入基质胶中孵育3 h后观察成血管情况并拍照。

1.9 Western-blot检测蛋白表达 总蛋白提取后,约50 μg总蛋白进行10%和12%的SDS-PAGE胶电泳,转膜后与稀释一抗(浓度是1∶1 000)4℃孵育过夜,切膜后缓冲液洗膜3次,每次10 min,室温下摇床二抗孵育1 h,显影并拍照。

1.10 统计学分析 实验数据均用SPSS22.0统计学软件进行处理,计量资料以(±s)表示,采用t检验。计数资料用率表示,采用卡方检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 QFG对HUVEC形态的影响 倒置显微镜观察结果显示HUVEC经不同浓度的QFG(0.25、0.5、0.75 mg/ml)干预 24 h 后,与对照组(0 mg/ml)比较,各浓度药物均对HUVEC的形态和细胞密度无明显影响。该结果表明浓度≤0.75 mg/ml的QFG对HUVEC的生长没有影响。见图1。

2.2 QFG对HUVEC活力的影响 MTT检测结果显示,HUVEC经不同浓度的QFG分别干预处理24 h和48 h后,HUVEC的活力受到不同程度的影响,当浓度≥0.75 mg/ml时,QFG对HUVEC活力具有明显的抑制作用,这种作用具有一定的剂量依赖性,但无明显的时间依赖性。见表1。

表1 QFG对HUVEC活力的影响(n=8,±s)

注:与对照组比较,△P<0.05,▲P<0.01。

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2.3 QFG对HUVEC迁移的影响 划痕实验结果显示QFG具有抑制HUVEC损伤修复能力的作用。划痕损伤24 h后,对照组HUVEC的划痕已经铺满细胞,而随着QFG给药浓度的不断增大,给药组HUVEC细胞划痕中间的距离不断增大,呈浓度依赖性。该结果证实QFG对HUVEC细胞迁移能力具有显著的抑制作用。见图2。

图2 QFG对HUVEC迁移能力的影响(×100)

2.4 QFG对HUVEC成血管能力的影响 体外成血管实验结果表明,与对照组比较,QFG处理后的HUVEC成血管能力随着给药剂量的增加而逐渐降低,表现出显著的剂量依赖关系,表明QFG具有抑制血管新生的作用。见图3。

图3 QFG对HUVEC成血管能力的影响(×100)

2.5 QFG对HUVEC细胞中 VEGF-A、VEGFR-2、MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响 蛋白表达检测结果显示,QFG对HUVEC细胞中VEGF-A、MMP-2、MMP-9蛋白表达具有显著调控作用。与对照组比较,随着给药浓度增加,VEGF-A、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平逐渐降低,呈现显著浓度依赖关系。见图4。

图4 QFG对HUVEC中VEGF-A、VEGFR-2、MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响

3 讨论

实体肿瘤内部血管生成与促血管生长因子的分泌和表达直接相关。目前,研究得较多而又透彻的促血管生长因子是血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)。其中,VEGF-A在多种正常组织器官如肺、肾、心、卵巢等中均有表达,同时它也是促进肿瘤血管生长的主要因子。VEGF-A通过增加血管通透性,导致血浆蛋白外漏,大量纤维蛋白酶原聚集后形成临时基质,使血管内皮细胞(Vascular Endothelial Cell,VEC)在血管外得以生存。VEC细胞的增殖和迁移是血管新生的核心,这与多种促血管生成因子有直接相关性,如VEGF-A、b-FGF、TGF-α、PDGF、IL-8 等[3~4]。本研究结果发现QFG具有抑制HUVEC细胞活力的作用,细胞形态学观察进一步佐证QFG可诱导HUVEC凋亡,同时抑制HUVEC的迁移及体外成血管能力,初步证实了QFG具有抑制肿瘤血管新生的作用,这可能是QFG抗肿瘤作用的机制之一。

当VEGF-A、VEGFR-2与VEC表面整合素αⅤβ3黏合后促进VEC增殖,而后在激活基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinas,MMP)作用下,向胞外域迁移[5]。基质金属蛋白酶对基底膜及壁细胞的降解起调控作用,MMPs会释放一些胞外基质中缺乏的促血管生长因子,降解血管基底膜,促进内皮细胞迁移及肿瘤血管的生成。MMP-2和MMP-9是MMP家族中重要的2个因子,血管新生启动过程的重要成员,可通过促进VEGF的释放及其他血管形成因子的表达促进肿瘤血管的新生,上调肿瘤的血管化[6]。有多篇报道证实中药通过调控MMPs及VEGF、VEGFR的作用抑制肿瘤血管生成,单体如大黄素、姜黄素、长春碱、喜树碱、苦参碱、去甲斑蝥素、小檗碱、丹参酮、川芎嗪等[7~13],复方如六神丸、薏苡仁注射液、参麦注射液、泽泻饮、鳖甲煎丸等[14~18]。中药抑制肿瘤血管新生的机制主要是通过抑制血管生成因子及其受体的表达如VEGF、b-FGF、VEGFR等,抑制基质金属蛋白酶及其抑制物的表达如MMP、TIMP,抑制黏附及趋化因子的表达如ICAM、CXCR等,抑制血管新生相关信号转导通路后降低微血管密度。本研究在明确QFG抑制肿瘤血管新生的作用后,进一步检测其对促血管生成因子VEGF-A、VEGFR-2及基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的表达调控,实验结果显示,QFG 显著抑制 VEGF-A、MMP-2、MMP-9 核心血管生成因子蛋白的表达。MMP-2和MMP-9是血管新生启动过程的重要成员,活化的MMP-2定位于细胞穿透基质的突出部位,MMP-9是以酶原的形式从胞内分泌到胞外,在酶解细胞间基质成分及基底膜的主要成分中起重要作用[19]。综上所述,QFG可能是通过影响血管生成核心因子的表达进而影响相关信号通路的调控,从而达到抑制肿瘤血管新生作用,相关结果还需进一步实验验证。

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