超灵敏敞开式质谱免疫分析用于血清及细胞表面的多蛋白同时检测

徐姝婷，马 雯，白 玉，刘虎威

(北京分子科学国家研究中心，北京大学化学与分子工程学院，分析化学研究所，北京 1000871)

研究背景：膜蛋白或分泌蛋白作为疾病的临床检测标志物和治疗靶标，对其表达水平的准确、快速、高灵敏检测具有重要的意义。传统酶联免疫吸附测定以及基于荧光或电化学的免疫测定方法，一定程度满足了高灵敏度及分析通量要求，但却存在谱带重叠、背景干扰严重、标记探针数量有限等瓶颈，限制其在少量样品中多目标同时检测中的应用。质谱具有高灵敏、高质量分辨率、定量准确等优势，目前，蛋白标志物的质谱检测主要包括直接测定以及基于元素标签和ICP-MS的质谱免疫方法，前者存在基质效应严重，离子化效率低，检测灵敏度不足问题；后者需要借助无机质谱和金属元素标签试剂增加分析成本，限制方法的简便和可拓展性。

研究思路及结果：研究工作建立了结合有机小分子标签实际和常压离子化质谱的超灵敏质谱免疫分析新方法。该方法中设计并合成了罗丹明系列的质谱标签分子(Rhodamine-based Mass Tags， RMTs)。这种质谱标签的结构可拓展性强，合成路线通用简便。其结构中的刚性烷基联和末端巯基确保了标签分子在金纳米粒子表面高效地自组装和离子化过程中的高效解离及信号放大。在接下来的源内CID分析中，离子化过程中生成的罗丹明类似物经进一步碎裂形成稳定的特征碎片离子，完成信号的二次放大及目标物的准确定量，从而确保了分析的高灵敏度及准确性。该质谱免疫分析平台以以氧化铟锡(ITO)玻璃芯片为主体。ITO芯片作为免疫识别和标记的固相基底，其表面能够形成识别单元-目标物-标签分子的“夹心”结构。该基底还参与质谱检测过程中的电喷雾加速基底电喷雾离子化(Electrospray Accelerated Chip SprayIonization， eCSI)过程。该离子化过程中的物理解吸或化学裂解过程能高效解离质谱标签分子。采用自动进样轨道可实现样品的快速、高通量多目标同时检测。

利用该分析平台，凝血酶加标样品的LOD分别为10.9 zmol(PBS)和35.1 zmol(血清)。相比于凝血酶直接质谱检测的0.4 pmol检测限，灵敏度提高了107倍。该方法实现了2 μL血清中CA125等生物标志物的检测，有望用于卵巢癌和乳腺癌的早期诊断。该平台还可实现低至25个细胞水平的OVCAR-3和MCF-7细胞表面的重要三种生物标志物(CA125，CEA和EpCAM)的同时、原位表达差异测定，显示了超高的灵敏度和多目标同时检测能力，且具有普适性和可拓展性。该平台能够实现微升级临床血样及几十个细胞水平样品的简便、快速、高灵敏且低成本的高通量筛查以及原位分析。

研究意义：该工作发展了膜蛋白生物标志物的超高灵敏度、高通量、多目标及操作简便的超灵敏常压质谱(AMS)免疫分析新方法。可实现微升级体液中zmol水平蛋白标志物的检测以及几十个细胞表面的疾病蛋白标志物的原位检测。在临床微量样本中多目标物同时筛查和疾病诊断，以及单细胞层面的目标蛋白监控和定量研究领域具有重要意义。