液相色谱-串联质谱法测定蜂王浆中新型烟碱类药物及其代谢物残留量

侯建波，谢 文，张文华，钱 艳，盛 涛，毛壬熠，姚志敏

(1.浙江省检验检疫科学技术研究院，浙江 杭州 310016；2.浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心，浙江 杭州 310016；3.浙江立德产品技术有限公司，浙江 杭州 310016；4.青海出入境检验检疫局检验检疫技术中心，青海 西宁 810003)

蜂王浆(royal-jelly)因富含蛋白质、脂质、碳水化合物、维生素和矿物元素，具有辅助控制血管扩张，降低血糖、血脂、血压，保护肝脏，抗菌消炎以及提高免疫力，抗衰老等医疗和保健功效，受到人们的关注与欢迎[1-2]。我国作为全球蜂王浆第一生产国，产品主要出口欧盟、日本和美国等发达国家和经济体[3-4]。伴随着蜂王浆营养价值认可度的不断提高，人们对其消费需求不断增长，对质量要求也越来越高，其中药物残留一直是衡量蜂王浆产品质量的重要指标。

新型烟碱类药物具有高效、低毒、内吸性强、有效期长、残留量低等特点，广泛用于农作物的害虫防治[5-6]。自20世纪80年代吡虫啉问世以来，已有如呋虫胺、噻虫胺、吡虫啉和啶虫脒等十几种商品化的新型烟碱类农药被广泛使用。研究表明，当蜜蜂接触新型烟碱类杀虫剂时，会引起蜂群落崩溃综合症(colony collapse disorder, CCD)，主要表现为蜜蜂迷失回巢方向，蜂王繁殖能力显著下降，从而导致蜂群的数量明显减少。该类杀虫剂会残留在蜜源植物和蜜蜂体内，导致蜂产品受到污染，从而对消费者的身体健康构成潜在威胁[7-9]。Mitchell等[10]研究表明，在采集的除南极洲外的全球六大洲蜂蜜样本中，有75%蜂蜜至少含有1种新型烟碱类杀虫剂，45%蜂蜜含有2种以上新型烟碱类杀虫剂，10%蜂蜜含有4～5种新型烟碱类杀虫剂。其中，已知34%蜂蜜中新烟碱类杀虫剂浓度对蜜蜂有害。为了保障消费者的健康，欧盟对蜂产品中部分新型烟碱类药物的残留限量进行了明确的规定[11]，列于表1，日本规定蜂产品中啶虫脒的最大残留限量为200 μg/kg[12]。

目前，新型烟碱类药物残留的测定主要集中在蔬菜、水果、粮食等植物源性产品中，对于蜂产品的检测以蜂蜜为主，常用的方法有气相色谱-质谱法[13-15]、高效液相色谱法(HPLC)[16-20]和液相色谱-串联质谱法[21-26]。我国制订的国家标准中涵盖了部分新型烟碱类药物残留的测定[14,27-28]，然而对于蜂王浆中新型烟碱类药物残留量的测定报道仍较少[29-30]。

表1 欧盟对蜂产品中新型烟碱类药物限量要求Table 1 Maximum residues limits (MRLs) of neonicotinoid insecticides in European Union

QuEChERS(quick, easy, cheap, effective, rugged, safe)净化方法具有回收率高、适用范围广、分析速度快、环境友好等特点，多用于食品中农兽药残留检测的样品净化。本研究拟通过QuEChERS分散固相萃取净化，采用液相色谱-串联质谱法测定蜂王浆中吡蚜酮(pymetrozine, PYM)、呋虫胺(dinotefuran, DIN)、烯啶虫胺(nitenpyram, NIT)、噻虫嗪(thiamethoxam, TMX)、氟啶虫酰胺(flonicamid, FLO)及代谢物4-(三氟甲基)烟酰胺(4-trifluoromethylnicotinamide, TFNA-AM)、吡虫啉(imidacloprid, IMI)、噻虫胺(clothianidin, CLO)、氯噻啉(imidaclothiz, IMTH)、啶虫脒(acetamiprid，ACE)及代谢物N-去甲基啶虫脒(N-desmethylacetamiprid, IM 2-1)、噻虫啉(thiacloprid, THIA)的残留量。以上新型烟碱类药物及其代谢物结构式示于图1。

图1 新型烟碱类药物及其代谢物结构式Fig.1 Chemical structures of investigated neonicotinoid insecticides and their metabolites

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

1260-6495型液相色谱-串联质谱仪：美国Agilent公司产品，配有电喷雾离子源；台式离心机：美国Thermo公司产品；Milli-Q超纯水器：美国Millipore公司产品；IKA MS3 Basic型涡旋器：德国IKA公司产品；氮吹仪：美国Organomation公司产品。

1.2 主要材料与试剂

N-丙基乙二胺(PSA)粉末，C18粉末和石墨化碳黑(GCB)粉末：中国上海安谱实验科技股份公司产品；无水硫酸镁(MgSO4)粉末：中国西陇科学股份有限公司产品；乙腈、甲醇、甲酸：均为色谱纯，德国Merck公司产品；乙酸铵、三氯乙酸：均为分析纯，中国国药集团化学试剂有限公司产品；实验用水：Milli-Q高纯水。

蜂王浆：杭州蜂之语蜂业股份有限公司产品；吡蚜酮、呋虫胺、烯啶虫胺、噻虫嗪、氟啶虫酰胺、吡虫啉、噻虫胺、啶虫脒、噻虫啉和N-去甲基啶虫脒标准品：纯度均为99%，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司产品；4-(三氟甲基)烟酰胺、氯噻啉、呋虫胺-D3、吡虫啉-D4标准品：纯度均为98%，加拿大Toronto Research Chemicals公司产品；噻虫嗪-D3、噻虫胺-D3、啶虫脒-D3和噻虫啉-D4标准品：纯度均为98%，加拿大C/D/N Isotopes公司产品。用甲醇将各化合物溶解，稀释并定容，得10 mg/L标准储备液，根据需要用甲醇将其稀释至所需浓度。

1.3 实验方法

1.3.1样品的提取 称取2 g蜂王浆样品(精确至0.01 g)于50 mL具塞离心管中，加入20 ng同位素内标和10 mL水，以2 000 r/min涡旋混合1 min，静置5 min；再加入甲醇至20 mL，以2 000 r/min涡旋混匀1 min，静置5 min；以8 500 r/min离心5 min，移取0.5 mL上清液，加入甲醇定容至10 mL；以2 000 r/min涡旋混匀，静置5 min，以8 500 r/min离心5 min，取1.0 mL上清液，待净化。

1.3.2样品的净化 将1.0 mL提取液转移至15 mL具塞离心管中(内含混合均匀的吸附剂：30 mg PSA、15 mg C18和50 mg MgSO4)，以2 000 r/min涡旋混匀30 s，吸附净化；以8 500 r/min离心5 min，转移全部上清液，于40 ℃下氮吹至近干，加入0.15%甲酸水溶液-甲醇(9∶1，V/V)，定容至1 mL，涡旋混匀，过0.22 μm滤膜，待LC-MS/MS测定。

1.3.3色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(150 mm×4.6 mm×5 μm)；流动相：A为含5 mmol/L 乙酸铵的0.15%甲酸溶液，B为甲醇；梯度洗脱程序：0～6.0 min(10%～70%B)，6.0～12.0 min(70%B)，12.0～14.0 min(70%～10%B)，14.0～18.0 min(10%B)；流速0.4 mL/min；进样量10 μL；柱温30 ℃。

1.3.4质谱条件 电喷雾离子源(ESI)；正离子扫描；多反应监测模式；毛细管电压3 000 V；离子源温度150 ℃；干燥气流速14 L/min；鞘气温度350 ℃，鞘气流速10 L/min。其他质谱条件列于表2。

表2 各化合物的基本信息及质谱测定条件Table 2 Information and optimized massspectrometric parameters of compounds

续表2

注：*表示定量离子对

2 结果与讨论

2.1 提取条件的优化

蜂王浆中的蛋白质对药物残留测定具有较大影响，为去除蜂王浆样品中的蛋白，本实验选择甲醇、乙腈、三氯乙酸3种试剂对蜂王浆基质沉淀蛋白质。结果表明，向蜂王浆中直接加入三氯乙酸溶液，其提取溶剂较难浓缩，且呋虫胺、噻虫啉和啶虫脒的回收率小于30%。使用乙腈沉淀蛋白，在离心后的上清液中补加乙腈进行稀释时，仍然会有白色絮状蛋白质沉淀出现。甲醇沉淀蛋白质的效果优于乙腈，因此，选用甲醇作为蛋白质沉淀和提取剂，各化合物的回收率均大于80%。

2.2 净化条件的优化

采用液相色谱-串联质谱法测定药物残留时，通常需要通过净化降低基质背景的影响。本实验分别考察了PSA、C18、GCB和无水MgSO4四种吸附剂对目标化合物的吸附情况，结果表明，在GCB(10、15、25 mg)存在的情况下，对吡蚜酮的吸附均达到80%以上，吡蚜酮的回收率小于20%。PSA、C18和无水MgSO4这3种吸附剂单独吸附实验的回收率均大于80%。进一步考察PSA、C18和无水MgSO4吸附剂不同用量组合的净化情况，结果示于图2，由图2可见，3种吸附剂的3种添加量对目标化合物的回收率无明显差异。综合实验结果和绿色化学、经济化学的理念，本实验采用30 mg PSA，15 mg C18和50 mg无水MgSO4的组合对目标体系进行净化。

图2 PSA，C18和无水MgSO4不同用量比例的净化结果Fig.2 Results of purification with different dosages for PSA, C18 and MgSO4

2.3 色谱条件的优化

采用甲醇-0.15%甲酸溶液(含5 mmol/L乙酸铵)、甲醇-0.15%甲酸溶液、乙腈-0.15%甲酸溶液(含5 mmol/L乙酸铵)、乙腈-0.15%甲酸溶液4种分离体系作为流动相进行梯度洗脱，对比目标化合物的分离效果。结果表明，当流动相含有乙酸铵时，各化合物的响应均显著提高，以甲醇为有机相时，氟啶虫酰胺、氯噻啉和吡虫啉的信号响应明显高于乙腈。因此，实验选择甲醇-0.15%甲酸溶液(含5 mmol/L乙酸铵)作为流动相进行分离测试。在该分离体系下，对比乙腈-0.15%甲酸水、乙腈-水、甲醇-0.15%甲酸水、甲醇-水4种定容溶剂的情况，结合色谱分离梯度洗脱程序，本实验选择甲醇-0.15%甲酸溶液(1∶9,V/V)作为最优定容溶剂。对比C8和C18两种色谱柱的分离效果，发现各化合物的峰值响应无明显差异，实验选用C18色谱柱进行实验。空白蜂王浆溶液的提取离子流图示于图3，向空白蜂王浆基质中添加5 μg/kg吡蚜酮、呋虫胺、烯啶虫胺和氯噻啉，12.5 μg/kg噻虫嗪、氟啶虫酰胺、噻虫胺、啶虫脒、N-去甲基啶虫脒和4-(三氟甲基)烟酰胺，25 μg/kg吡虫啉和100 μg/kg噻虫啉的分离情况示于图4。

图3 液相色谱-串联质谱法测定空白蜂王浆基质溶液的提取离子流图Fig.3 Extraction ion flow chromatograms of blank royal jelly by LC-MS/MS

2.4 质谱条件的优化

在正离子模式下，采用直接进样方式对1.0 mg/L待测化合物的标准溶液进行母离子全扫描，确定分子离子峰，再以分子离子为母离子，对其子离子进行全扫描，各化合物主要的子离子及其可能的碎片信息示于图5。按照欧盟EC/657指令，串联质谱法定量确证必须满足4个识别点的要求(母离子1点，特征子离子1.5点/个)，实验选择2个特征子离子进行测试，其中以信噪比高、峰形好、干扰小的离子对作为定量离子对。以多反应监测正离子模式优化各质谱参数，获得的最佳质谱条件列于表2。

2.5 方法线性关系和定量限

本实验通过测定混合溶剂标准溶液和空白蜂王浆提取溶液基质加标标准溶液，计算离子抑制率的方法考察基质效应[31-32]，结果列于表3。可见，各化合物的离子抑制率小于30%，即在蜂王浆基质中没有明显的基质效应。最终采用添加同位素内标物和0.15%甲酸水-甲醇溶液(9∶1，V/V)定容溶剂稀释配制标准工作曲线溶液两种方式进行定量测定。

图4 加标溶液的液相色谱-串联质谱分离结果Fig.4 Separation results of spiking solution by LC-MS/MS

该方法定量限以S/N=10计，吡呀酮和呋虫胺为2.5 μg/kg，烯啶虫胺、氯噻啉、啶虫脒和噻虫啉为5.0 μg/kg，噻虫嗪、氟啶虫酰胺、吡虫啉、噻虫胺、4-(三氟甲基)烟酰胺和N-去甲基啶虫脒为12.5 μg/kg。以标准品与同位素内标物峰面积比值y为纵坐标，以待测物质量浓度x(μg/kg)为横坐标，绘制各化合物的标准溶液工作曲线。其中，吡蚜酮、呋虫胺、烯啶虫胺和氯噻啉的浓度为0、5、10、50、100 μg/kg；噻虫嗪、氟啶虫酰胺、噻虫胺、啶虫脒、N-去甲基啶虫脒和4-(三氟甲基)烟酰胺的浓度为0、12.5、25、125、250 μg/kg；吡虫啉的浓度为0、25、50、250、500 μg/kg；噻虫啉的浓度为0、100、200、1 000、2 000 μg/kg，各化合物的相关系数r2>0.996。

2.6 方法回收率及精密度实验

在不含各目标化合物的蜂王浆中进行3个浓度水平5、10、50 μg/kg的吡蚜酮、呋虫胺、烯啶虫胺和氯噻啉，12.5、25 、125 μg/kg的噻虫嗪、氟啶虫酰胺、噻虫胺、啶虫脒、N-去甲基啶虫脒和4-(三氟甲基)烟酰胺，25、50、250 μg/kg的吡虫啉和100、200、1 000 μg/kg噻虫啉的添加回收实验，每个浓度水平取6个平行样，结果列于表4。可见，吡蚜酮、烯啶虫胺、氟啶虫酰胺、氯噻啉、4-(三氟甲基)烟酰胺和N-去甲基啶虫脒采用外标法定量，呋虫胺、噻虫嗪、吡虫啉、噻虫胺、啶虫脒和噻虫啉采用内标法定量，方法的总体回收率为81.2%～119%，相对标准偏差为1.7%～12.2%。

2.7 实际样品分析

应用本实验方法对市场采购的22批次不同品牌的蜂王浆样品进行测定，其中有1个样品的啶虫脒为43 μg/kg，在其他蜂王浆样品中未检测到新型烟碱类化合物及其代谢物。

3 结论

本实验建立了液相色谱-串联质谱测定蜂王浆中10种新型烟碱类药物及其两种代谢物残留量的方法。蜂王浆样品经水稀释，甲醇沉淀蛋白并提取待测药物，提取溶液经QuEChERS方法进行净化(分散剂为N-丙基乙二胺、C18和无水硫酸镁)，并通过C18色谱柱分离，液相色谱-串联质谱法多反应监测正离子模式检测，同位素内标法和外标法进行定量分析。该方法简便、快捷，定量限能够满足目前国内外相关化合物最大残留限量的要求。

注：a.吡蚜酮；b.呋虫胺；c.烯啶虫胺；d.噻虫嗪；e.氟啶虫酰胺；f.吡虫啉；g.噻虫胺；h.氯噻啉；i.啶虫脒；j.噻虫啉；k.4-(三氟甲基)烟酰胺；l.N-去甲基啶虫脒图5 各化合物的质谱图和可能的结构式Fig.5 Mass spectra and possible chemical structures of targeted compounds

化合物Compounds离子对MRMtransitions(m/z)溶液浓度Concentration/(μg/L)溶剂线性响应强度Intensityof solvent基质加标溶液响应强度Intensity ofspiked solution离子抑制率∗Ration of ionsuppression/%吡蚜酮218.1/105.20.255476460479-10.44呋虫胺203.1/129.10.2512512120054.05烯啶虫胺271.1/225.10.25179761506516.19噻虫嗪292.1/211.10.6255751461750-7.37氟啶虫酰胺230.1/203.10.62511123107273.56吡虫啉256.1/175.11.2549526472264.64噻虫胺250.1/169.10.625156931388111.55氯噻啉262.1/181.20.2511151921517.36啶虫脒223.1/126.10.6252820232698534.32噻虫啉253.1/126.15.0030615273430260-12.044-(三氟甲基)烟酰胺191.1/98.10.6251958221044-7.47N-去甲基啶虫脒209.1/126.10.6252501162398924.09

注：*离子抑制率(%)=(混合溶液中响应强度-空白王浆基质加标溶液响应强度)×100%/混合溶液中响应强度

表4 蜂王浆中新型烟碱类化合物的线性关系和回收率实验结果(n=6)Table 4 Results of liner relationship and recoveries of neonicotinoid insecticides in royal-jelly (n=6)

续表4