ASAP1和GSTM3基因多态性与肺结核易感性的相关性研究

张国栋 宋刚 李明辉

肺结核是一种因结核分枝杆菌感染导致的肺部传染病，患者的主要症状表现为淋巴结肿大、咯血及乏力等症状，对患者的生命安全造成严重危害[1]。肺结核的发生机制较为复杂，与患者的基因、病菌的毒性及生活环境等多种因素密切相关[2]。有研究发现单核细胞趋化蛋白-1及巨噬细胞移动抑制因子等重要免疫蛋白的基因多态性异常与结核分枝杆菌的易感性明显相关，这表明宿主的遗传因素对肺结核的发展有重要影响[3]。ADP核糖基化因子GTP酶活化蛋白1（Arf-GAP with SH3 domain ANK repeat and PH domain-containing protein，ASAP1）是一类分子量为 20～40 kD的单体GTP结合蛋白，与GTP酶激活蛋白结合后发挥GTP酶活性，可增强巨噬细胞内肌动蛋白应激纤维的功能，从而有利于细胞提升细胞运动能力[4]。谷胱甘肽硫转移酶 M3（glutathione S-transferase M3，GSTM3）是一种含225个氨基酸的蛋白，具有催化谷胱甘肽等抗氧化因子与超氧化物反应的功能，从而可减轻细胞内的氧化应激反应[5]。已有研究发现ASAP1及GSTM3基因多态性可对人体的免疫功能产生影响，从而降低机体对病菌的免疫能力[6]。本研究对肺结核患者中ASAP1基因及GSTM3基因多态性进行检测，分析ASAP1基因及GSTM3基因多态性与肺结核易感的相关性，为肺结核的高危人群筛选及临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择自2017年2月至2018年4月在重庆市长寿区公共卫生服务中心接受治疗的196例肺结核患者为病例组，其中男性109例，女性87例，年龄24～63岁，平均年龄（32.58±2.96）岁。选择在重庆市长春区公共卫生服务中心体检正常的160例健康人为对照组，其中男性84例，女性76例，年龄21～58岁，平均年龄（34.65±3.27）岁。纳入标准：①患者均为汉族并无遗传病；②患者均经影像学检查、痰结核菌涂片等方法确诊为肺结核病。排除标准：①患者的基本临床资料缺失；②患者伴发肿瘤、高血压及重要器官衰竭；③伴发哮喘、气管炎等呼吸系统疾病。所有研究对象均知情同意，且本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 试剂及仪器设备

基因组DNA提取试剂盒购自北京赛百盛基因技术有限公司，限制性内切酶购自美国NEB公司；PCR试剂盒购自金斯瑞生物科技有限公司。

1.3 基因多态性检测

采集受试者外周血5 mL，EDTA-Na2抗凝，按照全血基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，基因组DNA经Nanodrop分光光度计检测合格后，置于4℃冰箱保存。采用限制性片段长度多态性方法（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms，PCR-RFLP）分析基因型多态性，按照Prime 6.0软件设计引物，ASAP1基因T2475G位点：上游引物5′-CTGACGTCCATCCATCACTC-3′，下游引物 5′-CTGACGTCAGTCACTCATGCAC-3′。GSTM3基因A3207C位点：上游引物5′-GTCATCATCATCATCCATGCATC-3′，下游引物 5′-CTGGACTGCATCTGCATC-3′。PCR反应条件：95℃ 3 min；95℃ 10 s，58℃ 15 s，72℃25 s，反应32个循环，反应结束后72℃5 min。然后采用Kas I限制性内切酶处理ASAP1基因扩增产物，采用BsP63I限制性内切酶处理GSTM3基因扩增产物，将酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，分析酶切产物的条带数目判断基因型，同时将PCR扩增产物送至上海桑尼生物科技有限公司测序验证。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0处理数据，计量数据以均数±标准差表示，采用t检验；计数数据以率表示，采用χ2检验。肺结核易感性危险因素采用多因素Logistic回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组及病例组的一般资料

2组的年龄、性别、体重、身体质量指数（body mass index，BMI）、饮酒史及吸烟史差异无统计学意义（P＞0.05）。病例组的总胆红素为（1.36±0.24）mg/dL，C 反应蛋白（C-reactive protein，CRP）为（7.84±1.34）mg/L，白细胞数为（9.26±1.38）×109/L，均明显高于对照组（P＜0.05），见表1。

表1 2组一般资料对比Table 1 Comparison of the 2 groups of general data

2.2 ASAP1基因多态性与肺结核易感性的分析

病例组ASAP1基因T2475G位点基因型TT、GT及GG分别为59例、32例及105例，与对照组基因型分布差异有统计学意义（P＜0.05）。病例组T2475G位点G等位基因比例为68.6%，显著高于对照（P＜0.05），见表2。

2.3 GSTM3基因A3207C位点多态性与肺结核易感性的分析

病例组GSTM3基因A3207C位点多态性位点基因型AA、AC及CC分别为46例、67例及83例，与对照组基因型分布差异有统计学意义（P＜0.05）。病例组C等位基因比例为59.4%，显著高于对照组（P＜0.05），见表3。

2.4 肺结核易感性的危险因素分析

以肺结核感染为因变量，将本研究受试者的年龄、性别、体重、BMI、饮酒史、吸烟史、总胆红素、CRP、白细胞数值进行多因素Logistic回归分析，发现T2435G及A3207C位点多态性是肺结核感染的危险因素（P＜0.05），见表4。

表2 ASAP1多态性与肺结核易感性的相关性[n（%）]Table 2 Association between ASAP1 polymorphism and susceptibility of pulmonary tuberculosis[n（%）]

3 讨论

人体对结核分枝杆菌免疫机制较为复杂，巨噬细胞可吞噬侵入的致病菌，并将免疫信号传递至T淋巴细胞等其它免疫细胞，进一步增强人体对结核分枝杆菌的免疫能力[7]。有流行病学研究统计发现结核分枝杆菌的感染者中约有10%的感染者可转化为活动性肺结核，并且不同族群及人种的肺结核发病率有一定的差异，这表明宿主的基因遗传特征与肺结核的易感染性有密切关系[8-9]。麦志丹等[10]研究发现TNF-α-308基因多态性多态性与肺结核的易感性密切相关。有研究发现75.3%的肺结核患者ATG4A及ATG16L1基因多态性与健康者有显著差异[11]。这表明某些基因的多态性可能会对肺结核的易感性产生影响。有研究发现ASAP1及GSTM3基因多态性可能对免疫细胞的功能产生影响，从而降低机体对外界病菌的抵抗力[12]。因此，研究ASAP1及GSTM3基因与肺结核易感性的相关性有助于结核病的预防及治疗。

表3 GSTM3多态性与肺结核易感性的相关性Table 3 Association between GSTM3 polymorphism and susceptibility of pulmonary tuberculosis

表4 肺结核易感性的多因素Logistic回归分析Table 4 Multiple factor Logistic regression analysis of susceptibility of pulmonary tuberculosis

ASAP1蛋白主要位于细胞的高尔基体上，参与细胞囊泡物质运输，且是构成细胞伪足、黏着斑的重要组成分子，可增强某些细胞（如巨噬细胞）的黏附及运动功能[13]。已有研究发现当小鼠成纤维细胞内ASAP1基因转录或翻译发生障碍后，可导致细胞的伪足运动功能下降[14]。有研究发现结核分枝杆菌分泌的某些有毒物质可能干扰巨噬细胞ASAP1基因的表达，进一步削弱巨噬细胞对结核分枝杆菌的免疫功能[15]。本研究发现病例组ASAP1基因T2475G位点基因型TT的比例明显高于GT及GG型的比例，提示ASAP1基因T2475G位点与肺结核易感性相关。有研究通过RNA干扰技术下调巨噬细胞中ASAP1基因表达水平后，巨噬细胞识别、捕获结核分枝杆菌的能力明显下降，并干扰巨噬细胞向其它免疫细胞传递免疫信号[16]。Faghfoori等[17]研究发现ASAP1基因的多态性可影响肺结核患者的免疫功能，从而提高了结核杆菌对机体的侵染力。这表明ASAP1基因的多态性促使ASAP1蛋白活性降低或表达水平降低，导致巨噬细胞的识别及运动功能障碍，可能是导致肺结核易感性上升的诱因。GSTM3可以催化谷胱甘肽与细胞内的氧自由基等活性氧反应，因而可抑制活性氧对巨噬细胞、T淋巴细胞等免疫细胞的攻击，提高机体的免疫功能。有研究发现肺结核患者血浆中的GSTM3蛋白水平显著低于正常人，提示GSTM3与肺结核的发生密切相关[18]。本研究发现病例组GSTM3基因A3207C位点基因型CC比例明显高于AA及AC型的比例，提示GSTM3基因多态性对肺结核的发生产生影响。有研究发现肺结核患者GSTM3基因的A3207C位点为CC型的比例为51.4%，与肺结核易感性明显相关[18]，与本研究一致。这可能是由于GSTM3基因A3207C位点CC基因型促使GSTM3蛋白结构异常或转录水平下降，导致免疫细胞受到氧自由基或过氧化物攻击，从而降低患者的免疫系统功能。有研究通过TaqMan基因技术分析肺结核患者体内GSTM3基因中A3207G和C1305G位点多态性特征，发现这2个位点的基因多态性与肺结核易感性无显著相关性[19]。这表明GSTM3基因SNP位点多态性与肺结核易感性的关系较为复杂，GSTM3基因中的多个SNP多态位点可能产生交互作用，进而对GSTM3基因的表达产生不同的影响。多因素Logistic回归分析发现T2475G位点及A3207C位点的多态性是肺结核发生的危险因素。ASAP1基因及GSTM3基因多态性作为宿主的遗传特征，并不受外界干扰因素的影响，检测ASAP1基因及GSTM3基因多态性对筛查肺结核易感性人群有较高临床价值。

综上所述，ASAP1基因及GSTM3基因多态性与肺结核易感性密切相关，通过检测ASAP1基因及GSTM3基因多态性可评估受试者肺结核易感性。但由于影响肺结核的发病的基因较多，需进一步检测其它可能的易感基因进行综合分析，以期提高对肺结核的防治水平。