PPARGC1启动子甲基化与Ⅱ型糖尿病发病相关性分析

梁爽 王伟伟 孙力 邹广慧 董志武★

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是临床上常见的代谢性疾病，其中Ⅱ型糖尿病（type 2 diabetes Mellitus，T2DM）约占 DM 的 90%[1]。而 T2DM 发病机制复杂，遗传与环境在T2DM过程中发挥着重要的作用[2]。近年来，表观遗传学研究已成为研究糖尿病发病机制的热点。表观遗传学指在不影响DNA序列的情况下基因修饰的改变，主要包括DNA甲基化、染色质修饰、基因组印记等[3]，其中最常见的表观遗传修饰方式为DNA甲基化。DNA甲基化在胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸（cytosinephosphate-guanine，CpG）丰富的序列，也称为“CpG岛”，位于已知基因的启动子区域，其作用主要是导致基因表达的沉默[4]。

PPARGC1蛋白家族有3个成员：α，β和α相关协同激活因子，主要在富含线粒体的组织中表达，调节体内糖类与脂类代谢、脂肪酸β氧化、脂肪细胞分化等多种代谢过程[5]。有研究发现在多种糖尿病研究模型及人种中PPARGC1的异常表达，并参与了线粒体的生物形成和脂肪酸的β氧化等过程，是线粒体基因转录的关键因子[6]。另外研究显示PPARGC1参与T2DM的发病机制可能与患者胰腺PPARGC1启动子DNA甲基化水平升高，PPARGC1基因mRNA表达减少，从而引起胰岛素分泌减少相关[7]。因此，PPARGC1基因是研究T2DM发病机制的关键候选基因。

本研究旨在探讨T2DM的危险因素及PPARGC1启动子甲基化与T2DM发病的相关性，尝试从表观遗传学解释T2DM的发病机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取于2015年1月至2017年12月在上海市第六人民医院金山分院体检或住院期间诊断为T2DM的患者57例，将其归为糖尿病组；其中男22例，女35例，年龄 51～66岁，平均（59.00±3.01）岁；选取同期体检健康志愿者152例，确定为对照组；其中男 47例，女 105例，年龄 47～58岁，平均（51.00±3.23）岁。排除标准：既往明确诊断有除糖尿病以外的其他代谢性疾病，心脑血管疾病或肿瘤等疾病者以及妊娠期、哺乳期者。两组患者性别、年龄等一般资料上差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究由我院伦理管理委员会批准[伦研批第（201401）]，所有受试者均知情同意且签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本处理

将体检当日或入院次日清晨空腹采集静脉血3 mL置于促凝剂分离胶管中，1 500 rpm离心10 min，检测血清中空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和脂蛋白a（lipoprotein a，LPPA）的水平，另采集静脉血2 mL置于EDTA·K3抗凝管，采用美国Qiagen公司的全血基因组DNA提取试剂盒进行全血基因组DNA提取。

1.2.2 重亚硫酸盐直接测序

从糖尿病组和对照组中各随机选取26名研究对象进行基因组DNA提取，取1 μg提取的DNA样本进行重亚硫酸盐处理。以修饰后的DNA为模板，用Pfu DNA Polymerase高温聚合酶扩增PPARGC-1α基因启动子基因片段。通过Snapgene软件设计扩增引物，上游引物5′-CCGTGGGATTCCGTCAATCCCTCC-3′，下游引物 5′-CTCTTTTACAGAGTATTTTTACGTAGTAC-3′。PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪记录分析。将PCR纯化产物连接到pUC18-T载体上，待连接产物转化后进行蓝白斑实验筛选，筛选完利用M13+/-引物测序（ABI 3730XL测序仪，美国）。检测启动子基因片段中7个CpG位点，这些位点在基因序列中的位置为 28，53，86，217，252，348，354。

1.2.3 各生化指标的检测

所有研究对象于清晨空腹采集静脉血，离心分离血清。采用西门子全自动生化分析仪ADVIA2400（西门子公司，美国）及其配套相关试剂检测FPG、TG、TC、HDL-C、LDL-C和LPPA水平。所有检测均严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.4 信息调查

参考以往研究，以调查问卷方式收集并确认患者资料。问卷项目包括个人一般情况及个人健康情况，如高血压、冠心病、脑血管疾病，是否有家族遗传病史等一般资料，T2DM诊断参考临床诊断标准[8]。

1.3 统计学分析

采用Epidata3.1建立数据库，数据实行双录入法。应用SPSS 25.0软件进行统计学处理。对数据进行Komogorov-Smirnov（K-S）正态性检验，计量资料采用t检验和秩和检验进行处理，并分别采用均数和标准差的形式表示。分类资料采用χ2检验进行分析。Logistic回归方法分析糖尿病发生的危险因素，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 糖尿病组与对照组单因素统计分析

K-S正态分析研究2组对象的临床特征，身体质量指数（body mass index，BMI）、腰围、收缩压、TC、HDL和LDL符合正态分布；而年龄、身高、体重、舒张压、FPG，TG和LPPA不符合正态分布。分别采用t检验和秩和检验进行统计分析。结果显示，与对照组相比，糖尿病组病人的BMI（t=2.968，P＜0.05）、腰围（t=4.858，P＜0.05）和体重（Z=2.858，P＜0.05）均明显增高，且其平均年龄（Z=3.924，P＜0.05）均大于正常对照（表1）；对2组样本计数资料进行χ2分析，结果显示2组间糖尿病家族史差异有统计学意义（χ2=7.711，P＜0.05），其他指标均显示P＞0.05，差异无统计学意义。

2.2 糖尿病风险多因素回归分析

综合单因素统计分析结果，将单因素分析结果P＜0.05的变量进行多因素Logistic回归分析。以是否患糖尿病为因变量（0=否，1=是），以糖尿病家族史（X1）、年龄（X2）、腰围（X3）、体重（X4）及BMI（X5）作为自变量进行Logistic回归分析。根据变量赋值方式的约定，入选因素的参数估计值为正，则该因素的量化值越大，越促进糖尿病的发生；否则即为保护因素。同时，其对糖尿病患病的影响大小可由标准化参数估计值的大小来反映。由表2可知，糖尿病家族史、年龄、腰围均为导致糖尿病发生的不利因素，其OR值均＞1，糖尿病家族史OR值较大，意义更大。

表1 糖尿病组和对照组各个指标的比较Table 1 The comparison of each index between the type 2 diabetes mellitus group and the control group

表2 糖尿病发生影响因素的Logistic回归Table 2 The result of Logistic regression analysis of risk factors for type 2 diabetes mellitus

2.3 PPARGC1基因启动子甲基化与糖尿病关系回归分析

以是否患糖尿病作为因变量（0=否，1=是），以年龄（X1）、身高（X2）、是否 久坐（X3）、PPARGC-1α甲基化（X4）及最近测量血糖和血脂时间（X5）作为自变量进行Logistic回归分析，结果显示甲基化水平与糖尿病患病呈低度正相关（表3）。

表3 糖尿病发生影响因素的Logistic回归Table 3 The result of Logistic regression analysis of risk factors for type 2 diabetes mellitus

3 讨论

T2DM患病率随着人口老龄化和人们生活方式的转变呈现逐渐递增的趋势。据国际糖尿病联盟数据显示，目前全球糖尿病患者约4.15亿并预计在2040年达到6.42亿[9]。近年来的研究调查结果显示，T2DM与遗传和环境因素关系密切[2]，这两者通过表观遗传修饰的改变，特别是DNA甲基化，在连接遗传和环境因素的发病机制和进展中发挥作用，最终导致T2DM的发生发展[10]。有研究发现PPARGC1基因编码区突变与T2DM及相关代谢表型相关，其启动子变异也可能影响了PPARGC1的转录水平，从而参与T2DM疾病的发生[11]。

DNA甲基化水平受到环境、疾病、年龄和性别等因素的影响。已有研究证实，饮食、年龄及性别等环境因素与DNA甲基化修饰显著相关[12]。本研究通过对糖尿病组与对照组样本临床特征分析发现，2 组样本中，患者的 BMI（t=2.968，P＜0.05）、腰围（t=4.858，P＜0.05）和体重（Z=2.858，P＜0.05）、年龄（Z=3.924，P＜0.05）、糖尿病家族史（χ2=7.711，P＜0.05）为糖尿病患病危险因素；与前期研究结果相符[13]。进一步统计分析结果糖尿病家族史（OR=4.676；95%CI：1.788～12.230；P＜0.05）、年龄（OR=1.054；95%CI：1.013～1.097；P＜0.05）、腰 围（OR=1.064；95%CI：1.028～1.102；P＜0.05）均为导致糖尿病发生的不利因素；该结论也与其他相关研究结论相近[14-15]，结果提示年龄、腰围，尤其糖尿病家族史对T2DM预防和控制有积极意义。

T2DM的发生是一个复杂的过程。目前认为T2DM是由胰岛素抵抗与胰岛素分泌不足的双重缺陷共同作用所导致[16]。有研究显示T2DM过程中存在糖代谢、脂肪代谢以及线粒体能量代谢等多系统和多通路代谢异常。Brons等[17]的研究表明高脂肪的摄入会诱导胰岛素抵抗及增加PPARGC1基因的DNA甲基化程度，提示T2DM过程中存在脂肪代谢异常。Jiang等[18]的研究则提示T2DM过程可能涉及糖代谢异常。因此，探索该过程中的效应分子，进一步揭示T2DM的发病机制，有利于在T2DM的预防和治疗领域为我们提供新的启发。PPARGC1因其能够调节糖脂代谢和线粒体能量代谢，进而损伤胰岛β细胞，使葡萄糖刺激的胰岛素分泌减少而参与T2DM的发生过程，受到广泛关注。本研究采用重亚硫酸盐修饰测序技术检测PPARGC1基因甲基化水平。该技术既可以明确甲基化的确切位置，也可以检测甲基化的程度，是目前公认的DNA样品甲基化检测的推荐方法[19]。PPARGC1基因启动子甲基化在糖尿病发生中具有重要作用，甲基化水平与糖尿病患病呈低度正相关，之前有研究表明PPARGC1启动子C等位基因多态性与T2DM发病微弱关联[20]。

PPARGC1最早作为调控脂肪细胞分化的过氧化物酶体增殖物活化受体γ（peroxisome proliferator-activated receptors，PPARγ）的辅激活因子被发现，其后相继发现了其对下游靶转录因子调控的生物学功能。目前国内外普遍认为PPARGC1基因是T2DM中的关键候选基因，因其在人体能量代谢的调节中起核心作用，PPARGC1启动子的甲基化会影响其分子的正常表达，进而导致T2DM症状。因此，阐明PPARGC1启动子甲基化与T2DM的关系，有望为胰岛素抵抗T2DM的治疗提供思路。