雌激素对健康小鼠体内骨保护素及相关生化指标的影响

田菁菁,王 敏,李先平

(中南大学湘雅二医院检验科，湖南长沙 410011)

绝经后骨质疏松(PMO)是骨质疏松最常见的类型，骨保护素(OPG)又称破骨细胞形成抑制因子[1-2]。雌激素可通过增加骨中OPG的表达，抑制破骨性骨吸收，对去卵巢的骨质疏松有明显的治疗作用。以往针对雌激素抗骨质疏松情况的研究绝大多数以去卵巢小鼠为实验对象[3-5]，而少以健康小鼠作为研究对象。本实验旨在统计注射雌激素后小鼠体内OPG及骨代谢相关生化指标的变化情况及其相关性，以探讨其在骨质疏松中的意义，为骨质疏松的诊治提供依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 2018年3-4月42只无特定病原体(SPF)级美国癌症研究所(ICR)雌鼠，均购自湖南农业大学实验动物中心[SCXK(湘)2014-0001]，6周龄，平均体质量(22±2)克。实验前全部小鼠于SPF级环境分笼内，室内温度控制在20～25 ℃，相对湿度60%左右，照明12 h明亮，12 h黑暗，换气次数每小时18次，动物饲养笼具、饮水瓶定期消毒，所用垫料高压灭菌，饲养房内定期紫外灯消毒。喂食普通饮食，成分为6.5%脂肪、56%碳水化合物(2.5%糖)。

1.2仪器与试剂 应用雅培C8000全自动生化分析仪由雅培贸易(上海)有限公司提供；小鼠OPG ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，产品编号：EK0481。苯甲酸雌二醇注射液购自天津金耀氨基酸有限公司，国药准字H12020529，规格为1 mL∶1 mg。

1.3方法

1.3.1动物处理 取42只6周龄的ICR小鼠，分成A、B、C、D、E、F、G组，每组6只。实验前全部小鼠饲养与SPF级环境内。除G组(对照组)外，其余实验组(A～F组)小鼠每只注射0.5 mL的雌激素。分别在注射雌激素的第1、3、4、7、14和21天使用颈椎脱臼法处死,第1天即为当天；于注射雌激素前1天使用颈椎脱臼法处死G组小鼠。

1.3.2血清收集 A组小鼠在注射雌激素的当天行眼球取血，将采好的血于在37 ℃温箱保存2 h后在4 ℃冰箱内放置1 h，2 500×g离心10 min，分离并收集血清，储存于-20 ℃。B、C、D、E、F组分别在动物处死当天采用同样方法进行处理。G组于注射雌激素前1天收集血清并于-20 ℃保存。

1.3.3血清OPG的测定 室温溶解冻存血清，所有血清样本均使用样本稀释液对倍稀释；采用双抗夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定血清OPG；以吸光度值作为纵坐标，以浓度作为横坐标，使用各水平标准品(6 000、3 000、1 500、750、375、187．5、93．8 pg/mL)，绘制标准曲线图，并根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。

2 结 果

2.1OPG浓度标准曲线的制作 由ELISA法测出的标准浓度的数值用Excel做出标准曲线，所得曲线方程为Y=0.000 4X+0.164 1，相关系数为0.961 2，其中X为OPG的浓度,Y为测得的吸光度值。见图1。

图1 OPG浓度标准曲线图

2.2血清OPG含量比较 由得到的标准方程计算出各实验小鼠血清中的OPG浓度，其中对照组小鼠(G组)OPG水平为(3.540±0.65)ng/mL(P=1.000)。与健康小鼠相比，注射过雌激素的小鼠在刚注射雌激素后4 d内所取血清中OPG含量有明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；第4天以后的含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。实验组A～F组分别对应注射雌激素后第1、3、4、7、14和21天小鼠的OPG水平分别为(7.903±1.94)ng/mL(P=0.000)、(8.629±1.57)ng/mL(P=0.000)、(6.299±1.09)ng/mL(P=0.017)、(5.460±1.49)ng/mL(P=0.075)、(5.080±2.81)ng/mL(P=0.149)及(3.951±1.38)ng/mL(P=0.709)。每组小鼠与健康小鼠比均有增高，在第3天达到最高值。

2.3注射雌激素后各生化指标比较 与健康小鼠比较，各实验组小鼠血清中GGT含量和A、B、C组ALP含量明显升高，其中各实验组小鼠与对照组小鼠GGT比较，差异有统计学意义(P=0.000);而A、B、C组ALP水平与对照组比较，差异有统计学意义(P=0.036、0.008、0.002)。D、E、F组的ALP谷丙转氨酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酐(CREA)、尿酸(UA)、钙(CA)、磷(P)和镁(MG)的水平变化比较差异无统计学意义(P>0．05)。而各实验组间比较结果表明，除了A组与D组的ALT比较差异有统计学意义(P=0.033)外，其他组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4OPG、γ-GT及ALP的相关性分析 由图2～4可知，OPG、γ-GT和ALP之间存在正相关的趋势，故本实验采用SPSS13.0对这3个指标进行相关分析。结果显示OPG与ALP的相关系数为0.99，差异有统计学意义(P=0.000)，OPG的含量和GGT的相关系数为0.498，差异无统计学意义(P=0.255)，GGT与ALP的相关系数为0.528，差异无统计学意义(P=0.223)，见表1。

图2 各组OPG的均值曲线

图3 各组γ-GT的均值曲线

图4 各组ALP的均值曲线

项目OPGGGTALPOPG Pearson 相关性10.4980.993∗∗ 显著性(双侧)-0.2550.000 GGT Pearson 相关性0.49810.528 显著性(双侧)0.255-0.223 ALP Pearson 相关性0.993∗∗0.5281 显著性(双侧)0.0000.223-

注：**表示在 0.01 水平(双侧)上显著相关；-表示无数据

3 讨 论

骨为肌肉收缩提供附着并保护内脏，是重要的生命器官。一般认为骨在细胞水平的代谢不活跃，然而事实上骨细胞在不停地进行代谢，不仅骨细胞之间存在相互作用，骨髓中的红细胞生成细胞及基质细胞通过相互作用所构建的骨骼微环境，也是机体赖以进行骨的改建和重建的重要基础[6]。骨质疏松的发生发展是一个复杂的过程，近年来研究认为骨质疏松与衰老、雌激素下降、营养失调、疾病、药物和遗传基因等因素有关[7]，这些因素影响骨量的丢失与骨重建这一过程，当骨吸收大于骨形成时即导致骨质疏松[8]。绝经后骨质疏松是由于绝经女性的卵功能衰退，合成和分泌雌激素的功能下降，从而影响骨钙吸收，骨量大幅度下降而导致骨质疏松[9-10]。

骨量的维持由骨形成作用和骨吸收作用间的动态耦联和平衡完成。除骨细胞本身以外，许多激素及生长因子、细胞因子均参与这些过程的调控。骨量的丢失与否则取决于骨局部微环境中的细胞因子和生长因子的浓度及活性。尽管多种细胞因子或激素可以调控破骨细胞的分化成熟，但研究发现肿瘤坏死因子(TNF)超级家族的成员核因子κB受体活化因子配基(RANKL)和多集落刺激因子(M-CSF)为其决定因素[11]。在存在M-CSF的情况下，破骨细胞的前体细胞表达的核因子κB受体活化因子(RANK)可以和成骨细胞和基质细胞表达的RANKL配体结合，诱导破骨细胞前体细胞分化成破骨细胞;同时成熟的破骨细胞也表达RANK，它也可以与RANKL结合调节成熟破骨细胞的骨吸收活性。成骨细胞系的多种细胞分泌表达OPG，它与RANKL竞争性结合，阻止RANKL与RANK的结合，从而阻止破骨细胞活化及抑制骨吸收[12-13]。因此OPG对于骨代谢起着非常重要的作用。部分研究表明，体内各种激素和细胞因子包括rhIGF-1[14]和MT3T3-E1[15]等，均可通过影响破骨细胞上的OPG配体进而影响成骨细胞和骨髓基质细胞，调控破骨细胞水平，也从侧面反映了OPG的骨代谢调节作用。OPG作为骨代谢调控的终末因素，缺乏或者受到破坏时，可以出现各种骨代谢方面的异常。

另一方面，大量的基础研究已肯定了雌激素对骨质疏松的保护作用。体外实验表明,雌激素可刺激成骨细胞株OPG的分泌,阻断破骨细胞骨吸收信号的传递,从而拮抗去卵巢大鼠介导的骨质疏松[3]。在雌激素对抗骨质疏松相关机制的研究中，基于OPG的OPG/RANK/RANKL系统受到关注。国内外研究表明OPG具有抑制破骨细胞形成、分化、存活、活化并诱导破骨细胞凋亡的功能,其功能与RANKL密切相关,因为RANKL 是OPG的配体,OPG与RANKL结合抑制破骨细胞形成和活化,发挥抗破骨作用[16-17]。另外有研究表明，雌激素受体β沉默可通过ApoE影响 RANKL 通路和OPG水平，从而影响骨代谢水平[18]；成骨细胞中的雌激素β受体可通过调控IL-6及TGF-β从而影响RANKL/RANK/OPG通路[19],无不验证了雌激素水平与OPG水平的相关性。而绝经妇女体内雌激素缺乏导致骨中OPG表达量下降，外源性雌激素的应用则可阻止这种变化，将是未来治疗老年性骨质疏松的发展方向。以往研究大多以敲除卵巢或已患骨质疏松的动物为实验对象研究雌激素对骨代谢的影响作用，而鲜少将健康小鼠作为实验对象。

因此本实验利用给健康小鼠注射雌激素后测得血清中OPG的含量和骨代谢的一些生化指标质的变化情况，以期探讨雌激素对抗骨质疏松的作用。各实验组血清中OPG含量变化情况表明，与对照组比较，注射过雌激素的小鼠在刚注射后4 d内取的血清OPG的含量会明显升高,第3天达到峰值。在第3天以后OPG含量呈缓慢下降趋势，到达第21天时基本与正常水平持平。引起这种结果的原因与小鼠的个体差异和雌激素的药代动力学有关。从本实验原始数据可知小鼠间的个体差异较大。人体雌激素代谢时间为7～10 d[20]，研究者推断注射的雌激素在小鼠体内有类似或更短的作用时间，即随着雌激素的代谢，会出现OPG水平的下降。

除了测定上述OPG的结果以外，本实验同时测定了实验小鼠的肝肾功能和骨代谢的相关生化指标。本实验结果显示，与对照组相比，血清中骨代谢指标GGT、ALP水平明显升高。而其他肝肾功能的指标水平变化不明显，即排除是由于肝肾功能变化所致；健康人群的血清或血浆中测得的总ALP 几乎全部来自肝脏和骨骼系统[20]。血清总ALP不能完全代表其来源，因此常用γ-GT来鉴别ALP的来源[1]。本实验测定虽为血清总ALP,但由于已排除由肝肾功能变化所致，故可推测本实验所测得的ALP升高为骨源性升高。

相关性分析结果显示OPG、γ-GT、ALP的含量均明显增高且呈正向相关，进一步说明健康小鼠注射雌激素以后通过影响OPG水平使骨代谢产生变化。本实验选取健康小鼠而非去卵巢作为实验对象，更真实地模拟了一般情况下雌激素水平对骨代谢的影响；且短时间后OPG水平的下降也从侧面证明其与雌激素代谢时间的相关性。后续试验将继续就健康小鼠中雌激素水平导致OPG水平改变的机制进行研究及验证。本研究证明雌激素可以通过升高OPG水平从而抑制骨吸收，实现抗骨质疏松作用。

4 结 论

本研究结果发现，注射雌激素能在短期内使健康ICR雌鼠血清中的OPG、ALP、GGT等骨代谢相关指标升高。雌激素对OPG有促进作用，可以通过升高OPG水平从而抑制骨吸收，实现抗骨质疏松作用。