血清AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ及GGT联合检测在肝癌中的诊断价值研究

赵宗晨，董振芳，鞠 瑛，许 瑞

(山东大学附属省立医院临床医学检验部，山东济南 250021)

原发性肝癌是常见的恶性肿瘤之一，近年来的发病率和病死率呈逐年上升趋势[1]，肝癌早期无典型症状，大多数患者诊断肝癌已经是中晚期，而且预后较差，因此提高肝癌的早期诊断尤为重要。甲胎蛋白(AFP)是最广泛用于检测肝细胞肝癌诊断和检测的血清学肿瘤标志物，但是因其灵敏度和特异度不高，以AFP单个指标作为临床诊断依据时容易出现漏诊且无法满足临床需求[2-3]。近年来一种新的肿瘤标志物甲胎蛋白异质体3(AFP-L3)被临床应用，部分研究表明AFP-L3对早期肝细胞肝癌诊断较有效[4]。另外，许多研究学者发现维生素K缺乏或拮抗剂Ⅱ诱导蛋白(PIVKA-Ⅱ)对临床诊断肝癌具有较高的特异性[5]。在临床上常规的肝功能指标γ-谷氨酰转肽酶(GGT)方便快捷且费用低，在临床上应用广泛。本研究通过检测肝细胞肝癌与肝硬化患者的AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ及GGT表达水平，对比肝细胞肝癌与肝硬化阴阳性患者在性别、年龄、肿瘤直径、脉管内癌栓、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)等各方面的差异，探讨其独立及联合检测在肝细胞肝癌中的诊断价值，并进一步探究四者与病理分型之间的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年9月至2017年9月山东省立医院就诊的肝病患者174例，其中原发性肝癌的患者89例作为研究组，年龄为35～81岁，研究组患者均经手术病理证实诊断，并且取样时均未进行治疗；肝硬化未合并肝癌患者85例作为对照组，年龄为30～77岁。另选取本院体检健康者80例作为健康对照组，年龄为34～83岁。

1.2方法

1.2.1AFP-L3的分离 AFP-L3亲和吸附离心管及所需洗脱液等由北京热景生物技术有限公司提供。AFP-L3的分离采用微量离心柱法，离心柱内装有耦联了小扁豆凝集素(LCA)的琼脂糖作为亲和介质，可以特异结合AFP-L3。操作步骤：将研究对象血清400 μL加入600 μL清洗液，混匀后将已经稀释好的600 μL血清加入到耦联了LCA的琼脂糖离心柱中，当血清流过离心柱时，与LCA结合力强的AFP-L3就会留在离心柱中，使用清洗液洗去不结合的AFP，最后经专用洗脱液洗脱后，即获得处理后的标本，此标本中含有较纯的AFP-L3。

1.2.2检测方法 采用罗氏公司E601全自动电化学发光分析仪检测，检测试剂盒均为罗氏公司配套产品，抽取3组受试者3 mL清晨空腹静脉血，离心后分离血清，严格按照标准操作流程及试剂盒说明书测定质控品及受试者血清中的AFP及AFP-L3。使用日本富士公司LumipulseG1200全自动化学发光免疫分析系统检测PIVKA-Ⅱ的水平，检测试剂盒均为富士公司配套产品。使用AU5800检测GGT的水平，GGT 试剂盒为贝克曼库尔特有限公司提供。所有实验质控均在控。

1.2.3结果判读标准 AFP/AFP-L3=AFP-L3×2.5/总AFP×100%，该比例≥10%为阳性[6]，AFP>20 ng/mL为阳性，PIVKA-Ⅱ>40 ng/mL为阳性[7]，GGT>50 U/L为阳性[8]。

1.3统计学处理 采用SPSS13.0软件进行数据处理。计数资料以率表示，两组组间计数资料比较采用χ2检验；两组组间计量资料比较采用t检验；采用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析各指标对肝细胞肝癌的诊断价值,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组外周血AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ及GGT检测结果比较 研究组AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ指标均高于对照组及健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。研究组GGT高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

2.2外周血AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ及GGT的ROC曲线分析 ROC曲线越靠近左上角，表明其越接近最佳阈值诊断价值越高，四项指标对肝细胞肝癌的诊断性能见图1及表2。ROC曲线分析曲线下面积(AUC)显示，PIVKA-Ⅱ高于AFP、GGT、AFP/AFP-L3。

2.3四项指标阴阳性患者间性别、年龄、肿瘤直径、脉管内癌栓及HBsAg比较 AFP阳性患者与阴性患者在肝内脉管癌比较差异有统计学意义(P<0.05)；在性别、年龄、肿瘤直径、HBsAg比较差异均无统计学意义(P>0.05)；AFP/AFP-L3阳性患者与阴性患者在肿瘤直径、脉管内癌栓、HBsAg比较差异有统计学意义(P<0.05)；在性别、年龄比较差异均无统计学意义(P>0.05)。PIVKA-Ⅱ阳性患者与阴性患者在性别、肿瘤直径、脉管内癌栓、HBsAg比较差异有统计学意义(P<0.05)，年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。GGT阳性患者与阴性患者肿瘤直径及脉管内癌栓比较差异有统计学意义(P<0.05)；性别、年龄、HBsAg比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

图1 AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ及GGT的ROC曲线分析

组别AFP(ng/mL)AFP/AFP-L3(%)PIVKA-Ⅱ(ng/mL)GGT(U/L)研究组21.97(5.74,495.55)2.5(2.5,87.34)338(42.45,2 581)50(28,103)对照组4.045(2.41,9.92)2.5(2.5,2.5)18(14,26)40(23.5,90)健康对照组2.6(1.9,3.9)2.5(2.5,2.5)16.9(7.25,23.26)20(15,27.75)χ2/t1-5.352-5.902-8.297-1.244P1<0.05<0.05<0.050.213χ2/t2-8.044-6.536-9.512-7.789P2<0.05<0.05<0.05<0.05

注：中位数(四分位数)，χ2/t1、P1为研究组与对照组比较；χ2/t2、P2为研究组与健康对照组比较

表2 AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ及GGT对肝细胞肝癌诊断性能指标

表3 AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ、GGT阴阳性患者各指标比较(n)

续表3 AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ、GGT阴阳性患者各指标比较(n)

3 讨 论

肝细胞肝癌在我国属于较常见的恶性肿瘤，因癌细胞侵袭性强、恶性程度高、病程进展快等特点，往往治疗效果不佳，病死率较高。因患者早期症状不明显，明确诊断时多处于晚期，并且发病率和病死率居高不下，因此提高肝细胞肝癌患者的检测率对肝癌患者尤为重要。目前临床上主要是通过病理学、影像学及组织活检对肝细胞肝癌进行确诊，GGT是诊断肝胆疾病及灵敏的指标，在肝细胞肝癌中也成大量表达，可连同AFP及一些新的肝癌肿瘤标志物用于肝癌的辅助诊断[9-10]。较为常见的血清肿瘤标志物有AFP、癌胚抗原(CEA)、CA125、AFP-L3，PIVKA-Ⅱ等，单项肿瘤标志物存在假阴性和假阳性的问题从而导致诊断灵敏度和特异度不高，因此临床上多采用联合检测的方式来提高肝细胞肝癌的检出率[11]。

肝细胞及卵黄囊细胞合成分泌的AFP是一类糖原蛋白，主要是在胚胎时期合成，其他时期不合成或合成量微小，通常作为临床上首选的血清肿瘤标志物，为肝细胞肝癌的临床诊断做出了巨大贡献。另外，肝癌细胞可特异性产生AFP-L3，表现出早期血管浸润和转移趋势，且AFP-L3的比例与肿瘤的恶性程度呈正相关。有文献报道，AFP-L3不仅对于原发性肝癌的早期诊断和良恶性鉴别具有很高的临床价值，还可作为肝癌的预后指标[12]。PIVKA-Ⅱ是肝脏合成的无凝血活性的异常凝血酶原，研究表明PIVKA-Ⅱ产生机制可能与患者肝脏维生素K代谢异常、γ-羧基凝血酶原转录后表达异常和过多的凝血酶原前体产生有关[13]。由表1的结果证明研究组AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，这与秦燕等[14]研究结果一致。

本研究结果显示肝细胞肝癌及肝硬化患者的AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ及GGT均呈高表达，差异有统计学意义(P<0.05)。同一个肿瘤标志物往往会出现不同部位、性质的肿瘤患者血清中出现交叉现象，同一个肿瘤标志物在不同肿瘤性质中表达的程度不同，表2的结果显示4者单独运用中PIVKA-Ⅱ具有最好的AUC，其诊断性和特异度优于AFP，这与其他研究结果一致[15]。AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ及GGT联合运用显示最高的AUC。表3的结果显示AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ及GGT在肝癌脉管癌患者与非脉管癌患者中比较差异有统计学意义(P<0.05)。因此AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ及GGT为临床区分脉管癌患者提供了重要的参考价值。另外，统计分析发现AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ、GGT与肝细胞肝癌的大小有关，三者随着肿瘤直径的增大而提高，这也与司元全等[16]报道的AFP/AFP-L3与肝细胞肝癌的大小有关相一致。我国是乙型肝炎的高发区，以往通常认为乙型肝炎病毒感染与原发性肝癌没有关联。但是随着临床研究的不断深入，大多数证据表明，原发性肝癌主要诱发因素是乙型肝炎病毒感染[17]。本研究结果显示，各组AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ与HBsAg比较差异有统计学意义(P<0.05)，由此充分说明了AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ联合检测对乙型肝炎HBsAg阳性肝癌具有较高的诊断价值。PIVKA-Ⅱ阳性肝癌患者与阴性肝癌患者性别比较差异有统计学意义(P<0.05)，也与先前研究表明我国肝细胞肝癌患者中男性患者明显高于女性患者结果相一致[18]。

4 结 论

AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ及GGT联合检测能够明显提高肝细胞肝癌的检测率，并且AFP、AFP/AFP-L3、PIVKA-Ⅱ及GGT在评价肿瘤大小及脉内癌栓时也具有重要指导意义。同时也能更好地为HBsAg阳性患者为临床提供重要的参考价值。