人乳头瘤病毒16型和18型E6蛋白单抗制备及其鉴定

夏 斌，王芙蓉，严茹红，朱红楠，蔡培培△

(1.苏州科技城医院检验科，江苏苏州 215153；2.南京医科大学附属苏州医院检验科，江苏苏州 215153)

宫颈癌是现代女性常见的恶性肿瘤之一，全球范围内每年都有将近50万人新患宫颈癌，我国宫颈癌患病率就占了25%[1-5]，研究发现99%以上的宫颈癌都能够找到人乳头瘤病毒(HPV)感染的迹象，这些感染中主要型别是HPV16(约占53%)和HPV18(约占15%)[6-9]，HPV不能在体外经组织进行增殖培养，相应的抗原及抗体来源相对缺乏，使得有关HPV血清学检测方法的研究也因此相对比较滞后[10]，本研究利用蛋白原核表达和细胞融合技术制备HPV16E6、18E6特异性单克隆抗体，对HPV16、HPV18型别感染者的快速检测和诊断打下物质基础。

1 材料与方法

1.1实验材料 BL21-PET28a-16E6、BL21-PET28a-18E6工程菌株由本实验室前期构建；本实验室自备SP2/0细胞株；SPF级BALB/C小鼠由上海斯莱克实验动物有限公司提供。

1.2仪器与试剂 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导剂、次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)培养基、次黄嘌呤-胸腺嘧啶核苷(HT)培养基、融合诱导剂PEG4000由美国MERK公司提供；卡那霉素由上海生工生物工程公司提供；小鼠抗His-Tag单克隆抗体、弗氏完全佐剂和不完全佐剂由美国Sigma公司提供；胎牛血清、1640培养基、青霉素、链霉素由美国Hiclone公司提供； BCA蛋白浓度测定试剂盒由碧云天公司提供；HPV E6、HPV16E6、18E6蛋白由上海沪震实业有限公司提供；HR40-Ⅱ A2生物安全柜由青岛海尔特种电器有限公司提供；MCO-18AIC二氧化碳培养箱由三洋电机株式会社提供；超声破碎仪JY-250由浙江省三门超声波仪器厂提供；JS POWER-300电泳仪由上海培清科技有限公司提供；羊抗鼠IgG-HRP、Mulitskan MK3酶标仪由赛默飞世尔科技公司提供；96孔酶标板、96孔细胞培养板由美国Corning公司提供；His Trap FF亲和层析柱购自美国GE Healthcare公司。

1.3HPV16E6、18E6蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及定量

1.3.1HPV16E6、18E6基因诱导表达 BL21-PET28a-16E6、BL21-PET28a-18E6工程菌株在琼脂平板(含卡那霉素50 μg/mL)涂板活化后挑取单菌落接种于5 mL LB液体培养基(含卡那霉素 50 μg/mL)培养过夜，之后取菌液1∶100稀释作扩增培养至OD值为1.0，以终浓度为0.2 mmol/L IPTG诱导过夜后收集菌液。诱导产物作十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)分析,以稀释度为1∶2 000的小鼠抗His-Tag单克隆抗体作为一抗，稀释度为1∶2 000的羊抗鼠IgG-HRP为二抗作蛋白质免疫印迹法(Western blot)鉴定。

1.3.2HPV16E6、18E6重组蛋白的纯化及定量 收集诱导后菌液离心取沉淀，超声破碎菌体，取超声破碎后悬液的上清和沉淀同时进行SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝染色、脱色，观察是否在20×103、22×103的位置出现蛋白质条带，以确定重组蛋白以可溶性形式存在于超声裂解上清中。按照His Trap FF亲和层析柱使用说明书进行纯化操作，对纯化前和纯化后的产物分别进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)分析，考马斯亮蓝染色、脱色，分析纯化效果。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒对纯化后蛋白进行定量分析。

1.4HPV16E6、18E6蛋白单克隆抗体制备及其鉴定 以纯化的HPV16E6、18E6重组蛋白为免疫原免疫6～8周的BALB/c 小鼠。以HPV16E6、18E6蛋白作为抗原分别包被96孔酶标板，1∶10 000稀释度的HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗间接酶联免疫吸附测定(ELISA) 法测定BALB/c 小鼠血清抗体效价；以HPV E6抗原包被96孔酶标板，1∶10 000稀释度的HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗间接ELISA 法测定BALB/c 小鼠血清腹腔积液效价。取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞作细胞融合实验。采用以HPV16E6、18E6抗原分别包被96孔酶标板，1∶10 000稀释度的HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗间接ELISA 法筛选融合的阳性杂交瘤细胞，有限稀释法对阳性细胞进行单克隆增殖培养，以获取可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。Western blot对单克隆抗体进行鉴定，提取蛋白质并进行SDS-PAGE电泳、转膜，以抗His-Tag单克隆抗体作为一抗、羊抗鼠IgG-HRP为二抗，按照产品书进行孵育，ECL显色液显色。分析观察是否在20×103、22×103位置出现特异性条带。

2 结 果

2.1HPV16E6、18E6重组蛋白表达、纯化及定量结果 BL21-PET28a-16E6、BL21-PET28a-18E6 诱导和纯化后进行SDS-PAGE电泳，鉴定结果见图1，在诱导后出现相对高浓度的蛋白条带，并伴有杂带，在纯化后杂带消失。将IPTG诱导后进行 Western blot鉴定，结果显示，与BL21相比，HPV16E6、18E6在20×103、22×103处有明显条带，说明所诱导的表达蛋白即为目的蛋白，见图2。对所获得的蛋白质进行浓度测定，测得吸光度为0.650，根据本实验室绘制的标准蛋白浓度测定曲线，计算得出目的蛋白浓度为0.25 mg/mL。见图3。

2.2HPV16E6、18E6蛋白单克隆抗体制备及其鉴定结果 血清抗体效价测定结果显示HPV16E6 免疫后小鼠血清1∶16 000 稀释后高达1.219，见表1。

2.2.1腹腔积液效价测定 间接ELISA法检测结果显示，腹腔积液在作1∶512 000稀释后OD值仍高达0.937，效价高达106。

注：M为DNA标记物； 1为BL21 未诱导； 2为BL21诱导后；3为BL21-PET28a-16E6未诱导；4为BL21-PET28a-18E6未诱导；5为BL21-PET28a-16E6诱导后；6为BL21-PET28a-18E6诱导后；7为HPV 16E6纯化后；8为HPV 18E6纯化后

图1诱导表达蛋白的SDS-PAGE电泳分析

2.2.2细胞融合后阳性克隆筛选 脾细胞与骨髓瘤细胞融合后经筛选共得到3株阳性杂交瘤细胞。其中两株可分泌抗HPV16 抗体，分别命名为HPV16E6-2-G9、HPV16E6-2-F2；1株可分泌抗HPV18 抗体，命名为HPV18E6-3-H1，其中中间数字代表96孔板序号，后字母加数字代表在96孔板的位置，细胞培养液吸光度(A450，参考波长630 nm)分别为0.995、1.003、1.012。

2.2.3阳性克隆鉴定 以BL21、BL21-PET28a-16E6、BL21-PET28a-18E6为抗原，收集杂交瘤细胞HPV16E6-2-G9、HPV16E6-2-F2、HPV18E6-3-H1培养液为一抗，HRP标记羊抗鼠IgG为二抗，进行Western blot,结果显示杂交瘤细胞HPV16E6-2-G9、HPV16E6-2-F2分泌抗体可特异性与HPV16E6结合，见图4，HPV18E6-3-H1分泌抗体可特异性与HPV18E6结合，见图5。

注：M为DNA标记物；1为BL21；2为HPV16E6；3为HPV18E6

图2 HPV16E6、HPV18E6 Western blot鉴定

图3 HPV16E6、18E6蛋白标准曲线

蛋白类型1∶2 0001∶4 0001∶8 0001∶16 0001∶32 0001∶64 000空白对照HPV16E62.2901.7621.5001.0110.5530.3230.063HPV18E62.1231.7811.2190.7470.4670.2630.066

注：M为DNA标记物；1为BL21；2为BL21-PET28a-16E6(HPV16E6-2-G9)；3为BL21-PET28a-16E6(HPV16E6-2-F2)

图4抗HPV16E6单克隆Western blot鉴定

注：M为DNA标记物； 1为BL21； 2为HPV18E6(HPV18E6-3-H1第1次) ； 3为HPV18E6(HPV18E6-3-H1第2次)

图5抗HPV18E6单克隆Western blot鉴定

3 讨 论

在HPV感染患者中，亚型发生率最高的是HPV16型和HPV18型，这也是我国妇女宫颈癌的主要型别[11-12]。因此，加强对HPV16型和18型感染的检测对宫颈癌的早发现和早治疗具有极其重要的意义。一方面HPV的血清学研究对HPV流行病学研究具有重要价值，但另一方面由于条件限制现在还没有体外培养HPV的合适方法,所以很难要获得足够的HPV天然抗原作为研究材料。原核表达系统具有产量高、费用低廉方面的优势，通过降低诱导温度，控制诱导前细菌的浓度、降低诱导时转速和减少诱导时间可以明显促进目的蛋白的可溶性表达[13]，同时His标签不但不会使重组蛋白的生物学活性受到影响，而且还使得蛋白质的纯化和检测步骤更方便。本实验室通过预先构建的BL21-PET28a-16E6、BL21-PET28a- 18E6转化菌原核表达获得了大量的HPV16E6、18E6蛋白，经Western blot鉴定，证实了目的蛋白即是研究者所需要的蛋白。纯化的HPV16 E6、18E6融合蛋白作为免疫原免疫小鼠，取小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞作细胞融合，作单克隆培养，有限稀释筛选出2株分泌抗HPV16 E6及1株分泌抗HPV18E6的抗体，分别命名为HPV16E6-2-G9、HPV16E6-2-F2、HPV18E6-3-H1。Western blot 检测所筛选到的抗体，结果显示HPV16E6-2-G9、HPV16E6-2-F2只与HPV16型的E6蛋白发生抗原抗体反应，确认是抗HPV16 E6特异性单克隆抗体。 同样，HPV18E6-3-H1只与 HPV18型的E6蛋白发生抗原抗体反应，确认是抗HPV18 E6特异性单克隆抗体。通过制备小鼠腹腔积液，本实验成功地获得了大量的HPV16E6、18E6特异性单克隆抗体，腹腔积液检测显示出极高的效价，免疫结果良好。不仅为今后进一步研究HPV16、HPV18的致癌机制，提供了一个重要的实验资源，而且对HPV16、HPV18感染者的快速检测和治疗将具有重要的实际应用价值。

4 结 论

成功制备抗HPV16E6、18E6单克隆抗体，该抗体效价高，特异度好，为建立血清学诊断方法打下了基础。